1. Trasfezione miR-143 e miR-506
ATTENZIONE: Usa guanti in lattice, occhiali protettivi e un camice da laboratorio durante l'esecuzione degli esperimenti descritti. Quando necessario, utilizzare la cabina di biosicurezza con la ventola accesa, senza ostruire le vie aeree o disturbare il flusso d'aria laminare. Impostare sempre la finestra di protezione in vetro all'altezza appropriata, come descritto dal produttore.
- Seminare le cellule NSCLC A549 in un pallone T25 cm2/piastra a 6/96 pozzetti in terreno DMEM/F12K integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina (terreno di coltura) in una cappa di coltura tissutale e incubare per una notte a 37 °C con il 5% di CO2 in un incubatore per colture tissutali.
- Sospendere i mimici di miR-143 e/o miR-506 o codificare il siRNA con l'agente di trasfezione (2,4 μg di miR sono stati miscelati con 14 μL di agente di trasfezione; vedere la Tabella dei materiali) in 500 μL di terreno di trasfezione e 1,5 mL di siero e terreni DMEM/F12K privi di antibiotici a una concentrazione finale di miRNA di 100 nM. La quantità di miRNA può richiedere l'ottimizzazione su diverse cellule e concentrazioni. Gli approcci appropriati includono la trasfezione di cellule con concentrazioni crescenti di miRNA (cioè 50-200 nM) e la valutazione della sottoregolazione dell'espressione dei geni di interesse.
- Rimuovere il terreno di coltura dal pallone/piastra e lavare una volta con 1x PBS.
- Aggiungere complessi di miRNA/agenti di trasfezione scramble e incubare a 37 °C con CO2 al 5% per 6 ore (la dimensione del pallone definisce il volume di incubazione aggiunto).
- Sostituire il terreno con 4 mL di terreno di coltura e incubare le cellule per 24 ore e/o 48 ore.
- Raccogliere le cellule trasfettate mediante tripsinizzazione, aggiungendo 1 mL di tripsina-EDTA in ogni pallone da2 cm T25 cm, incubare per 5-10 minuti a 37 °C e aggiungere 3 mL di terreno di coltura per raccogliere le cellule. Mettere il contenuto di ciascun pallone in una provetta da 15 ml separata e contrassegnata. Lavora in una cappa per coltura tissutale.
- Centrifugare a 751 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
nota: È necessaria cautela durante la rimozione del surnatante, poiché l'agitazione della provetta può causare la perdita di cellule.
- Aggiungere 2 mL di 1x PBS e centrifugare per 5 minuti a 751 x g.
- Ripetere i passaggi 7 e 8 una volta per rimuovere eventuali tracce di terreno e surnatante.
NOTA: In questa fase, le provette per campioni possono essere conservate a -80 °C o possono essere utilizzate immediatamente.
2. Analisi del ciclo cellulare
- Seminare 5 x 105 cellule per ogni campione in un pallone da 25 cm2 ed eseguire una trasfezione secondo il protocollo descritto nella sezione 1, fasi 1-5.
- Dopo 24 ore e 48 ore, raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione.
- Trasferire le sospensioni cellulari in provette sterili da 15 mL ed etichettarle correttamente.
- Centrifugare i campioni a 751 x g per 5 minuti e scartare il surnatante.
- Aggiungere 2 ml di 1x PBS ghiacciato, vortex e centrifugare a 751 x g per 5 minuti. Scartare il surnatante.
- Ripetere la fase di lavaggio con 1x PBS per rimuovere i residui di fluido.
- Risospendere e rompere il pellet aggiungendo 200 μl di 1x PBS ghiacciato mediante pipettaggio.
- Fissare le cellule aggiungendo 2 ml di etanolo ghiacciato al 70% nel senso della provetta mentre si agita delicatamente.
- Incubare le provette per 30 minuti a RT e posizionare le provette a 4 °C per 1 ora.
- Togliere le provette da 4 °C e centrifugare a 751 x g per 5 min.
- Aggiungere 2 ml di 1x PBS ghiacciato, vortex e centrifugare a 751 x g per 5 minuti. Scartare il surnatante.
- Aggiungere 500 μL di 1x PBS con ioduro di propidio (50 μg/mL) e ribonucleasi A (200 μg/mL).
- Incubare per 30 minuti a RT proteggendo i campioni dalla luce.
- Acquisizione dei dati sul citometro a flusso. Utilizzare la dispersione in avanti rispetto a quella laterale (FSC rispetto a SSC) per selezionare la popolazione principale di celle, esclusi i detriti nell'angolo in basso a sinistra del grafico di densità FSC rispetto a SSC e i cluster di celle nella parte superiore e superiore destra del grafico di densità FSC e SSC.
- Analizza i dati per l'identificazione delle popolazioni cellulari per fase del ciclo cellulare con un software appropriato.