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1. Trasfezione miR-143 e miR-506
ATTENZIONE: Usa guanti in lattice, occhiali protettivi e un camice da laboratorio durante l'esecuzione degli esperimenti descritti. Quando necessario, utilizzare la cabina di biosicurezza con la ventola accesa, senza ostruire le vie aeree o disturbare il flusso d'aria laminare. Impostare sempre la finestra di protezione in vetro all'altezza appropriata, come descritto dal produttore.
- Seminare le cellule NSCLC A549 in un pallone T25 cm2/piastra a 6/96 pozzetti in terreno DMEM/F12K integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina (terreno di coltura) in una cappa di coltura tissutale e incubare per una notte a 37 °C con il 5% di CO2 in un incubatore per colture tissutali.
- Sospendere i mimici di miR-143 e/o miR-506 o codificare il siRNA con l'agente di trasfezione (2,4 μg di miR sono stati miscelati con 14 μL di agente di trasfezione; vedere la Tabella dei materiali) in 500 μL di terreno di trasfezione e 1,5 mL di siero e terreni DMEM/F12K privi di antibiotici a una concentrazione finale di miRNA di 100 nM. La quantità di miRNA può richiedere l'ottimizzazione su diverse cellule e concentrazioni. Gli approcci appropriati includono la trasfezione di cellule con concentrazioni crescenti di miRNA (cioè 50-200 nM) e la valutazione della sottoregolazione dell'espressione dei geni di interesse.
- Rimuovere il terreno di coltura dal pallone/piastra e lavare una volta con 1x PBS.
- Aggiungere complessi di miRNA/agenti di trasfezione scramble e incubare a 37 °C con CO2 al 5% per 6 ore (la dimensione del pallone definisce il volume di incubazione aggiunto).
- Sostituire il terreno con 4 mL di terreno di coltura e incubare le cellule per 24 ore e/o 48 ore.
2. Espressione proteica mediante microarray del ciclo cellulare degli anticorpi
- Seminare 5 x 105 cellule per ogni campione in palloni da25 cm ed eseguire una trasfezione secondo il protocollo descritto nella sezione 1, fasi 1-5.
- Dopo 24 ore e 48 ore, raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione.
- Trasferire le sospensioni cellulari in provette da 15 mL ed etichettarle di conseguenza.
- Centrifugare a 751 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
- Aggiungere 2 mL di 1x PBS ghiacciato, agitare e centrifugare a 751 x g per 5 minuti. Scartare il surnatante.
- Ripetere la fase di lavaggio con 1x PBS.
- Aggiungere 150 μL di tampone di lisi integrato con inibitori della proteasi. Pipetta su e giù delicatamente per distruggere le membrane cellulari.
- Per evitare qualsiasi interferenza del tampone di lisi, eseguire uno scambio di tampone per sostituire il tampone di lisi con il tampone di etichettatura, utilizzando le colonne di scambio del solvente del produttore.
- Quantificare la proteina totale con un saggio BCA.
- Prelevare 70 μg di campione proteico e aggiungere il tampone di marcatura per ottenere un volume finale di 75 μl.
- Aggiungere 100 μl di dimetilformammide (DMF) a 1 mg di reagente della biotina (biotina/DMF).
- Aggiungere 3 μL di biotina/DMF a ciascun campione proteico (campione di proteina biotinilata) e incubare per 2 ore a RT.
- Aggiungere 35 μl di reagente di arresto e mescolare a vortici.
- Incubare i campioni in RT per 30 min.
- Rimuovere i vetrini del microarray dal frigorifero in modo che si riscaldino a RT per 1 ora prima dell'uso.
- Eseguire il blocco per il legame aspecifico incubando i vetrini con una soluzione di latte secco al 3% (nel reagente bloccante fornito dal produttore) in una piastra di Petri con agitazione continua per 45 minuti a RT.
- Lavare i vetrini con acqua ddH2O (se non diversamente specificato, il lavaggio avviene con ddH2O).
- Ripetere la fase di lavaggio ~10 volte per rimuovere completamente la soluzione bloccante dalle superfici di scorrimento. Questo è importante per ottenere uno sfondo uniforme e basso.
- Rimuovere l'acqua in eccesso dalle superfici dello scivolo e procedere al passaggio successivo senza lasciare asciugare gli scivoli.
- Preparare la soluzione di accoppiamento sciogliendo il 3% di latte secco in un reagente di accoppiamento.
- Aggiungere 6 mL della soluzione di accoppiamento e l'intera quantità del campione di proteina biotinilata precedentemente preparato dalla fase 12.
- Posizionare un vetrino in un pozzetto della camera di accoppiamento fornita dal fornitore e aggiungere ~6 ml di miscela di accoppiamento proteico.
nota: Assicurarsi che il vetrino sia completamente immerso nella soluzione di miscela di accoppiamento proteico.
- Coprire la camera di accoppiamento e incubare per 2 ore a RT con agitazione continua in un agitatore orbitale.
- Trasferire i vetrini in una piastra di Petri e aggiungere 30 ml di tampone di lavaggio 1x. Mettere la capsula di Petri nell'agitatore orbitale, agitare per 10 minuti ed eliminare la soluzione.
- Ripetere il passaggio 24 2 volte.
- Sciacquare abbondantemente i vetrini con ddH2O acqua come descritto nei passaggi 17 e 18 e procedere immediatamente al passaggio successivo per evitare che si secchino.
- Aggiungere 30 μL di Cy3-streptavidina (0,5 mg/mL) in 30 mL di tampone di rilevamento.
- Posizionare il vetrino in una capsula di Petri e aggiungere 30 mL di tampone di rilevamento contenente Cy3-streptavidina.
- Incubare in un agitatore orbitale per 20 minuti con agitazione continua al riparo dalla luce.
nota: Cy-3 è un colorante fluorescente. Coprire con un foglio di alluminio o operare in condizioni di oscurità per mantenere l'intensità della fluorescenza.
- Eseguire i passaggi 24-26 e lasciare asciugare il vetrino utilizzando un leggero getto d'aria o posizionando il vetrino in una provetta conica da 50 ml e centrifugare a 1300 x g per 5-10 minuti.
- Posizionare il vetrino nel supporto del carrello e coprire con un foglio di alluminio.
- Scansiona il vetrino in uno scanner a microarray con le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione appropriate. Nel caso di Cy3, il picco della lunghezza d'onda di eccitazione è a ~550 nm e il picco di emissione a ~570 nm.
- Analizzare i dati (vedere la tabella dei materiali per il software utilizzato).