Preparazione del polmone di topo per citometria a flusso: generazione di sospensioni cellulari dal tessuto polmonare per l'analisi citofluorimetrica

Abstract

Fonte: Moll, H. P., et al. Trapianto ortotopico di cellule di adenocarcinoma polmonare singenico per studiare l'espressione di PD-L1. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video descrive la preparazione della sospensione di cellule polmonari di topo per l'analisi citofluorimetrica per studiare l'espressione di PD-L1 delle cellule di adenocarcinoma polmonare.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.

1. Preparazione del polmone per la citometria a flusso

1. Al punto finale sperimentale desiderato, sedare il topo mediante iniezione sottocutanea di una miscela di ketamina (100 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (10 mg/kg di peso corporeo) e sopprimerlo mediante lussazione cervicale.
2. Immergere la carcassa in etanolo al 70% e fissare il topo su una tavola di dissezione usando del nastro adesivo.
3. Praticare un'incisione ventrale sulla linea mediana e invertire delicatamente la pelle per esporre i muscoli della parete toracica e gli organi addominali. Forare il diaframma e tagliare le costole con le forbici per esporre la cavità toracica.
4. Perfondere i polmoni 3 volte con 6 - 8 ml di PBS ghiacciato attraverso il ventricolo destro utilizzando un ago da 27 G dopo aver praticato una piccola apertura nel ventricolo sinistro per consentire al sangue di uscire. I polmoni dovrebbero essere ripuliti dal sangue e diventare completamente bianchi.
5. Estrarre i polmoni e tritare i lobi in piccoli pezzi usando le forbici. Trasferire i pezzi polmonari in una provetta da microcentrifuga da 2 mL e incubarla in 1,5 mL di tampone per la digestione polmonare (RPMI, 5% FCS, 150 U/mL di collagenasi I e 50 U/mL di DNasi I).
6. Incubare i pezzi polmonari per 30 - 60 minuti a 37 °C e agitando costantemente.
7. Trasferire la sospensione di cellule polmonari attraverso un filtro cellulare da 70 μm in una provetta da 50 mL. Pulire il colino con il retro di una siringa sterile da 10 ml e sciacquare il colino con 15 ml di PBS con FCS al 2%.
8. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti a 4 °C e aspirare il surnatante. Risospendere le cellule in 1 mL di tampone lisanti ammonio-cloruro-potassio (ACK) e incubarle per 5 minuti a temperatura ambiente per la lisi degli eritrociti residui.
9. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti a 4 °C e risospendere le cellule in 1 mL di PBS con FCS al 2% e procedere con il protocollo di colorazione desiderato per la citometria a flusso
   nota: In alternativa, le cellule possono essere risospese in RPMI contenente il 30% di FCS e il 10% di DMSO e congelate utilizzando un contenitore di congelamento per un'analisi successiva.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Linea cellulare di adenocarcinoma polmonare di topo			Interno isolato
C57Bl/6 topi			F1 della croce dei due sfondi può essere utilizzato (8-12 settimane)
Mouse 129S
RPMI 1640 Medio	Tecnologie per la vita	11544446
Siero fetale di vitello	Tecnologie per la vita	11573397
Soluzione di penicillina/streptomicina	Tecnologie per la vita	11548876
L-Glutammina	Tecnologie per la vita	11539876
Ketasolo (100 mg/mL di ketamina)	Ogris Pharma	8-00173
Xilasolo (20 mg/mL di xilazina)	Ogris Pharma	8-00178
Pinze smussate	Roboz	RS8260
Forbici per iride per studenti	Strumenti per la scienza	Codice: 91460-11
DNasi I (senza RNasi)	Biolaboratori del New England	Codice: M0303S
Collagenasi Tipo I	Tecnologie per la vita	17100017
ACK Tampone di lisi	Lonza	10-548E