Articolo metodologico

Saggio di immunofluorescenza: un metodo per identificare le cellule tumorali catturate su un filo medico

30 aprile 2023

In questo articolo

Abstract

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Fonte: Gallerani, G. et.al., Caratterizzazione delle cellule tumorali utilizzando un filo medico per catturare le cellule tumorali circolanti: un approccio 3D basato sull'immunofluorescenza e sul DNA FISH. J. Vis. Exp. (2017).

Questo video descrive la tecnica di colorazione in immunofluorescenza delle cellule tumorali circolanti catturate su un filo medico funzionalizzato. Il filo funzionalizzato consente l'isolamento delle CTC in vivo, direttamente dal flusso sanguigno del paziente.

Protocollo

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1. Immuno-DNA FISH su filo

  1. Spike-in della linea cellulare su filo (supporto 3D)
    nota: Il set-up preliminare prevede un'accurata selezione di linee cellulari aderenti in base alla positività per EpCAM. Il filo è funzionalizzato con anticorpi anti-EpCAM in modo che vengano colorate solo le cellule EpCAM-positive.
    nota: Non toccare la parte funzionalizzata del filo per evitare danni.
    nota: Tutte le fasi devono essere eseguite in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili.
    1. Risospendere l'intero contenuto di un pallone T75 (confluenza all'80%) in un flaconcino da 5 mL utilizzando 4 mL di terreno completo; per un singolo spike-in, si consigliano circa 2.000.000 di cellule per massimizzare l'adesione delle cellule al filo.
    2. Rimuovere il filo dalla sua confezione di vetro.
    3. Immergere la parte dorata funzionalizzata del filo nella fiala, assicurandosi che il fermafilo sia a tenuta stagna per la fiala. Sigillatura con film da laboratorio.
      nota: Si consiglia l'uso di provette da 5 mL per consentire una corretta corrispondenza tra il fermafilo e la fiala.
    4. Incubare per 30 minuti a RT in un rotatore per provette (angolo 0-120).
    5. Sciacquare il filo tre volte in una soluzione di 1× PBS utilizzando 3 diverse fiale pulite.
  2. Fissazione e permeabilizzazione
    cautela: L'acetone è una sostanza infiammabile che può irritare le vie respiratorie. Utilizzare solo contenitori in plastica o vetro resistenti all'acetone (senza PVC o PVDF).
    nota: Eseguire questi passaggi sotto una cappa chimica.
    1. Asciugare il filo all'aria.
    2. Fissare le cellule immergendo il filo in una soluzione di acetone al 100% per 10 minuti a RT. Utilizzare una provetta da 5 mL.
      nota: Il fermafilo non deve entrare in contatto con il fissativo.
    3. Asciugare il filo all'aria per 5 minuti a RT.
      nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Il filo deve essere conservato a -20 °C. Quando si imballa il filo per la conservazione a lungo termine, posizionare il fermafilo accanto alla punta funzionalizzata e inserire con cura il filo nel tubo di vetro di stoccaggio, facendo attenzione a non danneggiare la punta funzionalizzato. Chiudere il vetro di stoccaggio e conservare (verticalmente o orizzontalmente) a -20 °C.
  3. Immunofluorescenza Giorno 1
    nota: Questa fase prevede un'incubazione notturna (~ 16 h).
    1. Lavare due volte in una soluzione di 1× PBS utilizzando una provetta da 5 ml.
    2. Incubare il filo in un tampone di diluizione anticorpale per 30 minuti a RT utilizzando una provetta da 5 mL.
    3. Preparare 150 μl di miscela di anticorpi con una diluizione di anticorpi primari monoclonali coniugati con fluorocromo in tampone di diluizione anticorpale, come specificato nella scheda tecnica. Ad esempio, l'anticorpo EpCAM-FITC è stato utilizzato con una diluizione 1:20.
    4. Utilizzare una punta p200 per eseguire l'incubazione, come segue: estrarre il filo dal fermafilo e inserire delicatamente il filo attraverso il foro più grande della punta. Inserisci prima l'estremità non funzionalizzata e tira lentamente il filo attraverso il foro più piccolo fino a quando la parte dorata non si trova appena oltre il foro più grande.
    5. Far cadere delicatamente 150 μl della miscela di anticorpi (ad esempio anticorpi anti EpCAM_FITC 1:20 diluiti) nel puntale. Per evitare il rischio di formazione di bolle, far roteare delicatamente il filo fino a quando la parte funzionalizzata non è completamente immersa.
    6. Sigillare il foro della punta. Avvolgere la pellicola di laboratorio attorno al foro può aiutare.
    7. Incubare verticalmente per una notte (~ 16 h) al buio a 4 °C.
  4. Immunofluorescenza giorno 2
    1. Bloccare l'incubazione degli anticorpi lavando il filo due volte in 1× PBS.
    2. Reinserire il filo nel suo fermafilo.
      nota: Conservare in 1X PBS a 4 °C in un flaconcino da 5 mL fino all'esecuzione del test FISH.

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
etanolo Carlo Erba # 414605
Interpolazione 20 BIO RAD# 1706531
PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) Medicago# 09-9400-100
acetone Sigma Aldrich # 534064-500ML
IN GOMMAPER CEMENTO Talens Reali # 95306500
EpCAM-FITC (clone: HEA-125)Mitenyi#130-080-301
RPMI 1640 Gibco# 31870-025
XT ALK BA Sonde MetaSystems # D-6001-100-OG
Detektor CANCER01 EpCAM Gilupi Nanomedizin Filo funzionalizzato
Microscopio fluorescente ZEISS Axioskop Zeiss
Software Nikon NIS-Elements BR 4.11.00 a 64 bit Nikon
Fotocamera digitale Nikon DS-QiMc a 12 bit Nikon DS-QiMc

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Cellule tumorali circolantimicroscopia a fluorescenzacolorazione con anticorpifissazione cellularelavaggio con PBSincubazione con anticorpifilo funzionalizzatorilevamento della fluorescenza

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