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1. Raccolta di campioni di plasma
- Raccogliere 10 mL di campione di sangue intero in provette Vacutainer con K2EDTA rivestito a spruzzo e conservare a temperatura ambiente.
nota: Per ridurre al minimo l'emolisi, separare il plasma entro 2 ore. Non conservare il sangue intero a bassa temperatura (cioè 4 °C) per evitare shock termici e lisi cellulare che portano a un rilascio di miRNA aspecifico.
- Entro 1 ora, separare il plasma con una prima fase di centrifugazione a 1.258 x g e 4 °C per 10 minuti.
- Trasferire il surnatante plasmatico in una provetta da 15 mL, evitando accuratamente il contatto con l'anello linfocitico.
- Centrifugare il plasma una seconda volta a 1,258 x g e 4 °C per 10 minuti.
- Aliquotare 1 mL di plasma in crioviali da 1,5 mL, evitando di raccogliere la frazione plasmatica alla base della provetta.
- Conservare tutte le aliquote a -80 °C, tranne una per la valutazione dell'emolisi. L'analisi molecolare deve essere eseguita entro 5 settimane.
2. Estrazione dell'RNA totale nel plasma
- Preparare una soluzione di 1-tioglicerolo/omogeneizzazione (OMG) con 20 μl di 1-tioglicerina per mL di soluzione di omogeneizzazione. Poiché l'1-tioglicerolo è viscoso, pipettare con cura per una misurazione accurata. Raffreddare la soluzione OMG con ghiaccio o a 2-10 °C prima di utilizzarla.
nota: La soluzione di lavoro è stabile a 2-10 °C per 1 mese.
- Sospendere la DNasi I liofilizzata aggiungendo 275 μL di acqua priva di nucleasi nella fiala e mescolare delicatamente (non vorticare). Come ausilio visivo, aggiungere 5 μl di colorante blu alla DNasi I ricostituita e dosare la soluzione in aliquote monouso in provette prive di nucleasi. Conservare la DNasi I ricostituita a una temperatura compresa tra -30 °C e -10 °C.
- Partendo da 200 μl di plasma, aggiungere 200 μl della soluzione OMG raffreddata.
- Vortex 15-30 s per garantire una completa omogeneizzazione. In caso di formazione di schiuma, lasciare che il campione si depositi sul ghiaccio.
- Aggiungere 200 μL di tampone di lisi e 25 μL di proteinasi K al campione omogeneizzato e agitare per 20 s.
- Incubare i campioni per 15 minuti in un termomiscelatore preriscaldato a 37 °C.
- Caricare una cartuccia per ogni campione sul vassoio del ponte dello strumento e posizionare il plugger nella posizione corretta.
- Trasferire il lisato nella posizione appropriata nella cartuccia dello strumento.
- Aggiungere 5 μl di soluzione di DNasi I nella posizione corretta nella cartuccia.
- Aggiungere 60 μl di acqua priva di nucleasi alla base di ciascuna provetta di eluizione.
- Seleziona il metodo "RSC miRNA Tissue" e inizia la purificazione automatizzata. I campioni di RNA totale possono essere conservati a -80 °C.