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1. Sezionamento GMA.
- Preparare una soluzione di ammoniaca allo 0,05% con acqua distillata. Posizionare il coltello di vetro e la biopsia nel microtomo. Allineare con cura il blocco per biopsia con la lama regolando il supporto del coltello e l'angolo del blocco per biopsia in modo che la lama poggi in piano contro la superficie del blocco.
- Tagliare sezioni spesse 2 μm utilizzando il microtomo a una velocità di taglio lenta e utilizzare una pinza per trasferire e far galleggiare le sezioni sull'acqua di ammoniaca. Far galleggiare le sezioni per 45-90 secondi, consentendo un delicato recupero dell'antigene e lo svolgimento della sezione.
- Raccogli le sezioni con il vetrino del microscopio. Controllare l'istologia della biopsia colorando rapidamente con blu di toluidina.
- Asciugare i vetrini su una piastra calda impostata a 50 °C e applicare 500 μl di colorante blu di toluidina filtrato su una sezione utilizzando una pipetta di plastica Pasteur. Scaldare la sezione sulla piastra riscaldante fino a quando un anello verde inizia a emergere sul bordo della macchia, quindi lavarla via con acqua.
- Utilizzando un microscopio ottico, controllare l'istologia della biopsia. Le sezioni utilizzate per l'immunoistochimica dovrebbero contenere buone aree di lamina propria ed epitelio non danneggiati, con il minor numero possibile di ghiandole e il minor numero possibile di muscolatura liscia.
- Tagliare le sezioni che hanno una buona istologia e raccoglierle con vetrini da microscopio rivestiti di poli-lisina (rivestiti con PLL) per la colorazione immunoistochimica. Tagliare almeno due sezioni da ogni biopsia per l'analisi. Asciugare gli scivoli per almeno 1 ora. Dopo l'essiccazione, le sezioni possono essere avvolte in carta stagnola e conservate a -20 °C per un massimo di 2 settimane, oppure possono essere immediatamente immunocolorate.
2. Colorazione immunoistochimica di biopsie endobronchiali incluse in GMA
NOTA: L'azide di sodio è tossica. Preparare la soluzione di sodio azide allo 0,1% all'interno di una cappa aspirante e lontano dagli acidi. Il contatto con gli acidi libera gas tossici.
- Disegna le sezioni usando una penna a punta di diamante e disponi i vetrini su un rastrelliero per colorare.
- Eseguire un blocco della perossidasi. Preparare una soluzione di blocco di perossidasi di perossido di idrogeno allo 0,3% in una soluzione di azoturo di sodio allo 0,1%. Applicare 1 ml di blocco di perossidasi sulle sezioni e incubare per 30 minuti.
- Preparare una soluzione di lavaggio di soluzione salina tamponata con Tris 0,05 M (TBS), pH 7,6. Lavare i vetrini in TBS, 3x 5 min.
- Preparare una soluzione di blocco BSA all'1% in DMEM. Fallo in anticipo e in grandi volumi, aliquotalo e congelalo fino al momento del bisogno. Drenare i vetrini e incubare le sezioni in soluzione a blocchi per 30 minuti per bloccare il legame degli anticorpi aspecifici. Se il legame non specifico persiste, includere una fase di incubazione di 30 minuti con un blocco di siero al 5% della stessa specie dell'anticorpo secondario.
- Diluire l'anticorpo primario (CD45 o CD1a) in TBS alla concentrazione desiderata (CD45 diluito a 1:1.000; CD1a diluito a 1:1,00) e applicarlo sui vetrini. Vetrino coprioggetti le sezioni e incubazione per una notte a RT.
- Lavare le diapositive in TBS tre volte. Diluire l'anticorpo secondario biotinilato (diretto contro la specie ospite dell'anticorpo primario, in questo caso l'anti-topo di coniglio F(ab'2)) in TBS alla concentrazione desiderata (diluizione 1:300) e applicarlo ai vetrini. Incubare per 2 ore a RT.
- Preparare un complesso di streptavidina biotina-perossidasi almeno 30 minuti prima dell'uso. Assicurati che ce ne sia abbastanza per coprire tutte le diapositive. Lavare i vetrini in TBS tre volte. Applicare la soluzione sui vetrini e incubare per 2 ore a RT.
- Lavare i vetrini in TBS tre volte. Preparare la soluzione di substrato di perossidasi 3-ammino-9-etilcarbazolo (AEC) (prodotta secondo le istruzioni del produttore). Applicarlo sui vetrini e incubare per 20-30 minuti o fino a quando non si sviluppa l'intensità di colorazione desiderata.
- Sciacquare i vetrini in acqua corrente del rubinetto per 5 minuti. Controcolorare le sezioni con la soluzione filtrata di ematossilina di Mayer per 2 minuti. Lavare i vetrini in acqua corrente del rubinetto per 5 minuti.
- Svuotare i vetrini e coprire le sezioni con un mezzo di montaggio acquoso permanente. Asciugare i vetrini a 80 °C in un forno di essiccazione. Lasciare raffreddare i vetrini, quindi montarli con DPX e posizionare un vetrino coprioggetti.