Isolamento degli esosomi: una tecnica per separare gli esosomi dal plasma di pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule

Abstract

Fonte: Giallombardo, M., et al. Analisi dei miRNA esosomiali nel plasma dei pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) attraverso qPCR: uno strumento di biopsia liquida fattibile. J. Vis. Exp.(2016).

Gli esosomi isolati al plasma possono essere utilizzati come un modo non invasivo e ripetibile per il rilevamento e il follow-up dei biomarcatori per la diagnosi precoce e la progressione della malattia. Questo video descrive il protocollo per la separazione degli esosomi dai campioni di plasma di pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule, che potrebbero essere utilizzati per l'estrazione di DNA e proteine.

Protocollo

1. Isolamento degli esosomi

Nota: L'isolamento degli esosomi dai campioni di plasma, è stato eseguito con un kit commerciale, secondo il protocollo del produttore e aggiungendo il trattamento con RNAsi: (tutti questi passaggi devono essere eseguiti con dispositivi di protezione personale e ambientale e seguendo una specifica procedura legale per la manipolazione di campioni biologici).

1. Prelevare 1 ml di plasma di ciascun campione, conservato a -80 °C, e metterlo su ghiaccio.
2. Centrifugare il campione a 2.000 × g per 20 minuti a RT; questo passaggio è obbligatorio per rimuovere cellule e detriti.
3. Trasferire il surnatante contenente il plasma pulito in una nuova provetta da 1,5 ml.
4. Centrifugare la nuova provetta a 10.000 × g per 20 minuti a RT.
5. Trasferire il surnatante contenente il plasma pulito in una nuova provetta da 1,5 ml.
6. Aggiungere 100 ng/ml di RNAsi al surnatante e incubare la provetta a 37 °C per 10 minuti per degradare gli RNA circolanti.
7. Trasferire tutto il plasma trattato in una nuova provetta da 2 ml e aggiungere 0,5 volumi di 1x PBS.
8. Agitare il campione per mescolare le soluzioni.
9. Aggiungere 0,05 volumi di soluzione di proteinasi K (da includere nel kit) al campione.
10. Agitare il campione e incubare a 37 °C per 10 minuti.
11. Aggiungere 0,2 volumi di tampone di precipitazione dell'esosoma al campione e mescolare le soluzioni per inversione.
12. Incubare il campione a una temperatura compresa tra 2 °C e 8 °C per 30 minuti, quindi centrifugare il campione a 10.000 × g per 5 minuti a RT.
13. Aspirare e scartare il surnatante. Il pellet contiene gli esosomi isolati.
14. Aggiungere il tampone selezionato al pellet dell'esosoma per risospendere gli esosomi. La selezione del buffer dipende dall'analisi a valle prevista, in questo caso:
    1. Aggiungere 100 μl di 1x PBS per eseguire l'analisi TEM.
    2. Aggiungere 346,5 μl di tampone di lisi specifico per l'estrazione dell'RNA (dal kit commerciale) (ATTENZIONE: pericolo chimico).
    3. Aggiungere 100 μl di tampone di lisi per l'estrazione delle proteine (Tris-HCl 50 mM pH 7,6 - NaCl 300 mM - Triton X-100 0,5% - PMSF 1 mM - Leupeptina/Aprotinina 10 μg/ml) per eseguire l'analisi Western Blotting. (ATTENZIONE: pericoli chimici).
15. Conservare gli esosomi risospesi a -20 °C.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit per l'isolamento totale degli esosomi (dal plasma)	Invitrogen	4484450	Utilizzare il trattamento con proteinasi K
Ribonucleasi A	Sigma-Aldrich	R4875-100MG
RNAspin Illustra mini kit 50	GE HealthCare	Codice 25-0500-71