3D DNA FISH: una tecnica per localizzare un gene specifico su un cromosoma

In questo articolo

Abstract

Fonte: Gallerani, G. et.al. Caratterizzazione delle cellule tumorali utilizzando un filo medico per catturare le cellule tumorali circolanti: un approccio 3D basato sull'immunofluorescenza e sul DNA FISH. (2017).

L'isolamento e la caratterizzazione delle cellule tumorali circolanti (CTC) dal sangue dei pazienti oncologici è un tipo di biopsia liquida non invasiva ed è associata a recidiva e progressione della malattia. Questo video descrive la tecnica di ibridazione in situ a fluorescenza del DNA (DNA FISH) su CTC catturate su un filo medico, per studiare uno specifico gene di interesse.

Protocollo

1. 3D DNA-FISH Giorno 2

ATTENZIONE: Particolare attenzione deve essere prestata all'alta temperatura degli strumenti e della camera umida.

Impostare il forno di ibridazione e il forno a calore secco (~ 3 ore prima di iniziare il protocollo DNA-FISH). Impostare il forno di ibridazione a 75 °C, impostare il forno a calore secco a 37 °C e raffreddare la soluzione di SSC 0,4× (pH = 7,0 ± 0,1) a 4 °C.
nota: Lo stato del pH dei tamponi FISH è critico e deve essere compreso tra 7,0 ± 0,1.
Lavare il filo 3 volte in soluzione di SSC 0,4× ghiacciata.
nota: Tenere il filo al buio per evitare il fotosbiancamento al fluorocromo durante le seguenti procedure.
Asciugare per 10 minuti al buio sotto la cappa aspirante.
Vorticare e far girare la sonda per 5 s.
Far cadere 10 μl della sonda nelle microprovette di vetro. Coprire con pellicola da laboratorio.
Centrifugare le microprovette come segue: avvolgere la microprovetta in un assorbente asciutto, mettere la carta in una provetta da 50 ml e centrifugare brevemente.
Posizionare con cautela il filo essiccato nel microtubo e inserire il fermafilo. Guarnizione con gomma cement.
cautela: Le due fasi successive prevedono temperature elevate. Indossare guanti protettivi.
Mettere il filo in una camera umida e buia nel forno di ibridazione per 8 minuti a 75 °C per ottenere la completa denaturazione del DNA.
Spostare la camera umida in un forno a calore secco a 37 °C per una notte.

2. 3D DNA-FISH Giorno 3

Mettere a bagnomaria un barattolo colorante per vetrini con soluzione di SSC 0,4× e impostare a 72 °C.
Controllare la temperatura della soluzione di SSC 0,4× fino a raggiungere i 72 ± 1 °C.
Preparare due becher di vetro, uno con soluzione di SSC 2× + 0,05% Tween (pH = 7,0 ± 0,1) e il secondo con acqua distillata.
Rimuovere la camera umida dal forno a calore secco, rimuovere con cura il cemento di gomma dal fermafilo usando una pinzetta ed estrarre il filo.
nota: Tirare con cautela l'estremità non rivestita del filo attraverso l'IN-Stopper, facendo attenzione a non danneggiare la punta funzionalzzata.
Immergere il filo nella soluzione di SSC 0,4× per 2 minuti a 72 °C.
Lavare il filo in una soluzione 2× SSC + 0,05% Tween per 30 s a RT.
Lavare il filo in acqua distillata a RT.
Asciugare il filo sotto la cappa aspirante per 10 minuti al buio.
Preparare una soluzione madre DAPI da 1,43 μM in 2 mL da 1× PBS.
Incubare la punta funzionalizzata del filo con la soluzione DAPI in un flaconcino da 2 mL per 1 ora al buio a RT.
Sciacquare il filo due volte in 1× PBS e asciugare all'aria.

3. 3D osservazione e analisi al microscopio

Posizionare il filo nel supporto del filo. Inserire con cautela la punta funzionalizzata attraverso il punto di ingresso dell'apposito supporto, fino a quando la punta non corrisponde al punto di aggancio. Fare attenzione a non danneggiare la punta funzionalizzata (Figura 1a).
Posizionare il supporto speciale sul tavolino del microscopio. Regolare la messa a fuoco del microscopio utilizzando una lente da 20×. Prima mettere a fuoco grossolanamente il supporto speciale e poi regolare con precisione le celle che appaiono luminose nel canale DAPI.

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Risultati

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Figura 1: Filo funzionalizzato, disposizione schematica delle sonde di rottura ALK, schema dei modelli attesi di riarrangiamento di ALK e supporto speciale.(a) Le caselle rosse evidenziano le tre parti principali del filo: punta funzionalizzata, fermafilo e punta non funzionalzzata. La punta funzionalizzata è la parte più delicata del filo e non deve essere toccata d...