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1. Fissazione e lavorazione delle fette di tessuto
- Sollevare con cautela il riferimento 0 h non fermentato o la fetta di coltura su una carta da filtro imbevuta di PBS.
- Per fare ciò, aggiungere 2-3 ml di PBS sopra una carta da filtro posta in una piastra di 10 cm. Posiziona la fetta sopra la carta da filtro ed estrai la carta da filtro usando un paio di pinze.
- Trasferire la carta da filtro in un'istocassetta e aggiungere una goccia di ematossilina diluita (1:1 in acqua deionizzata) sopra la fetta di tessuto per segnare visibilmente la posizione della fetta durante le successive fasi di lavorazione (Figura 1D).
- Chiudere la cassetta e trasferirla in una soluzione di formalina tamponata neutra al 4%. Fissare i fazzoletti durante la notte a 4 °C.
nota: Mentre si posiziona la fetta sopra la carta da filtro, assicurarsi che la parte superiore della fetta sia rivolta verso l'alto; Ciò è necessario per seguire la sezione superiore, centrale e inferiore di una fetta durante il sezionamento e l'analisi, come descritto nel passaggio 2.3.
- Il giorno successivo, trasferire le cassette in EtOH al 70% e procedere immediatamente con la fase di lavorazione del tessuto che include paraffina.
- Prima del trattamento dei tessuti, lavare le istocassette in 100% EtOH 2x per 10 minuti ciascuna. In questo caso, utilizzare una stazione a microonde per il trattamento dei tessuti. Selezionare il programma utilizzato per uno spessore del tessuto di 1 mm e seguire le istruzioni fornite nel manuale (https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf).
nota: Quando si utilizzano altre macchine per la lavorazione dei tessuti, utilizzare il programma adatto per campioni di tessuto sottili.
- Per l'inclusione della paraffina, aprire un'istocassetta e utilizzare un bisturi per sollevare con cautela la fetta dalla carta da filtro. Scartare la carta da filtro e trasferire la fetta in uno stampo contenente paraffina liquida.
- Premere il tessuto contro il fondo dello stampo di inclusione, ad esempio con un peso piatto, per garantire un sezionamento uniforme. Posizionare la parte inferiore dell'istocasette sopra lo stampo, aggiungere sopra la paraffina liquida. Lasciare raffreddare lo stampo su un patè freddo per 30 minuti e separare lo stampo dal blocco di paraffina.
nota: In alternativa all'inclusione orizzontale, è possibile incorporare la fetta tumorale verticalmente posizionando la fetta in posizione verticale. Le sezioni verticali consentono facilmente l'analisi dei gradienti di vitalità o di espressione dei marcatori funzionali su una singola sezione. L'analisi del gradiente con fette incorporate orizzontalmente richiede il sezionamento della paraffina come descritto nel passaggio 2.2.
2. Elaborazione e analisi di tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE)
- Preparare sezioni sottili di 4 μm dei blocchi di fetta di tessuto FFPE utilizzando un microtomo. Durante il sezionamento, regolare l'angolo del blocco in modo che la superficie del blocco sia orientata orizzontalmente rispetto alla lama; Questo è necessario per ottenere sezioni uniformi in tutto il tessuto.
- Per consentire l'acquisizione di un potenziale gradiente di vitalità indotto dalla coltura, la migrazione cellulare attraverso le fette o i gradienti nell'espressione dei biomarcatori tra le fette coltivate, raccogliere sezioni dagli strati superiore, centrale e inferiore di ciascuna delle fette di tessuto sui vetrini dell'oggetto come spiegato di seguito.
- Raccogliere le sezioni sequenziali di tessuto della fetta di tessuto inclusa in paraffina prima sulla parte superiore dei vetrini. Continuare a raccogliere le sezioni degli strati di tessuto più profondi al centro, seguite dalla parte inferiore dei vetrini (Figura 1E).
nota: Per sistemare tre sezioni su un vetrino, tagliare via l'eccesso di paraffina che circonda la fetta di tessuto incorporata.
- Lasciare asciugare le sezioni per una notte a 37 °C e procedere con la colorazione H&E o l'immunoistochimica come descritto di seguito.
nota: La perdita di antigenicità può verificarsi quando le sezioni FFPE vengono conservate ad alte temperature o per lunghi periodi di tempo. Si consiglia di conservare le sezioni di paraffina a 4 °C e le analisi IHC devono essere eseguite entro 6 mesi dal sezionamento.
- Per la colorazione H&E, deparaffinare e reidratare le sezioni di paraffina come segue: xilene 3 volte per 5 minuti, 100% EtOH 3 volte per 1 minuto, 96% EtOH 2 volte per 1 minuto, 70% EtOH 1 x 1 minuto e acqua deionizzata 2 volte per 1 minuto.
- Incubare le sezioni in una soluzione di ematossilina appena filtrata per 10 minuti e lavarle sotto l'acqua corrente del rubinetto per 5 minuti. Immergere le sezioni in alcol acido (1% HCl in 70% EtOH) per 2 volte e lavare sotto l'acqua corrente del rubinetto per 5 minuti seguita da incubazione con eosina allo 0,5% per 2 minuti.
- Dopo la fase di eosina, disidratare le sezioni immergendo i vetrini in soluzioni di alcol e xilene, come segue: 96% EtOH 2x per 15 s, 100% EtOH 3x per 30 s, xilene 3x per 1 min. Infine, incorporare le sezioni in un mezzo di montaggio a base di xilene.
