1. Isolamento dei neuroni
Una volta terminata la raccolta dell'estratto/surnatante, continua con l'isolamento dei neuroni.
- Per i neuroni DRG, raccogliere il DRG cervicale e lombare di ratti neonati tra il giorno postnatale (P) 2-12 dopo la decapitazione e la dissezione stereomicroscopica di DRG (Figura 1A). Per avere un numero sufficiente di neuroni DRG per una piastra a 24 pozzetti, raccogliere tutti i DRG cervicali e lombari di un ratto neonato (pari a 52 DRG) per piastra.
- Tagliare le proiezioni periferiche (neurali) e centrali (radici) del DRG per mezzo di microforbici. Lasciare le proiezioni in posizione impedisce la triturazione e aumenta il rischio di contaminazione della coltura da parte dei fibroblasti.
- Per i neuroni MP, tagliare il mesentere dall'intestino tenue e rimuovere manualmente e con cura lo strato sieromuscolare dell'intestino tenue (per un protocollo dettagliato sull'isolamento MP, Figura 1B). Per l'MP, raccogliere il plesso da due ratti per piastra a 24 pozzetti.
nota: Cerca di essere il più delicato possibile per evitare lacerazioni nello strato sieromuscolare poiché ne impediscono la corretta separazione dall'intestino tenue.
- Raccogliere il DRG e lo strato sieromuscolare in un terreno minimo essenziale (MEM) ghiacciato fornito con gentamicina (20 mg in terreno da 500 ml) e metronidazolo (2,5 mg in terreno da 500 ml).
- Dopo la raccolta dei DRG, incubarli nella soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) fornita con collagenasi di tipo II per 20-30 minuti. Per l'isolamento MP, incubare in collagenasi tra 1 e 3 ore, a seconda dell'età dell'animale (Figura 1C).
- Per l'MP, raccogliere i pezzi di MP a rete sotto uno stereomicroscopio e trasferirli su un MEM ghiacciato.
- Quindi triturare il DRG e l'MP attraverso siringhe con diametro decrescente.
nota: Un'eccessiva triturazione può distruggere i neuroni, ma meno le cellule gliali.
- Una volta che il terreno contenente il DRG o l'MP è diventato torbido, centrifugare la sospensione a 93,9 x g per 5 minuti, scartare il terreno e risospendere in terreno neurobasale (integrato con 100 U/ml di penicillina, 100 μg/ml di streptomicina, 0,5 mM di L-glutammina e 2% di B-27).
- Contare il numero totale di cellule (cioè neuroni E glia) per mezzo di un emocitometro.
nota: Il numero di celle necessarie dipende dal parametro di misurazione. Per la quantificazione della densità dei neuriti, sono necessarie colture più dense e quindi un numero maggiore di cellule rispetto alla misurazione della crescita dei neuriti, delle dimensioni pericarionali e del modello di ramificazione dei singoli neuroni. Per le misure della densità dei neuriti, utilizzare ad esempio 10.000 cellule (neurone+glia)/pozzetto o 1.500 neuroni/pozzetto. Per la morfometria su singoli neuroni, si raccomanda una breve tripsinizzazione (1 minuto) delle cellule e la semina di 2.500 cellule/pozzetto o 400 neuroni/pozzetto. La resa tipica delle cellule ottenute da un ratto è di circa 300.000-500.000 cellule.
- Seminare le cellule su vetrini coprioggetti da 13 mm che sono stati rivestiti la sera prima e ricoprire i pozzetti con terreno neurobasale (integrato con 100 U/ml di penicillina, 100 μg/ml di streptomicina, 0,5 mM di L-glutammina e 2% di B-27) (Figura 1D).
nota: Utilizzare vetrini coprioggetti rivestiti di poli-D-lisina (40 mg/m2) O vetrini coprioggetti rivestiti di ornitina e laminina (1 mg/ml ciascuno). Le cellule si attaccano alla poli-D-lisina in modo estremamente rapido, rendendola così adatta per esperimenti in cui sono necessarie molte cellule (ad esempio misure di densità dei neuriti). L'attaccamento alla laminina è in generale un po' più debole, ma la laminina è un forte promotore della crescita dei neuriti. Pertanto, per le misurazioni sulla ramificazione neuronale e sulla lunghezza dei neuriti, preferire il rivestimento di ornitina/laminina.
- Lasciare che le cellule si attacchino ai pozzetti durante la notte. Il giorno successivo, preparare il terreno integrato con estratto (a una concentrazione finale di estratto/surnatante di 100 μg/ml).
- Aspirare il terreno di semina ed eseguire un lavaggio facoltativo molto delicato con PBS, quindi pipettare lentamente il terreno integrato con estratto/surnatante (Figura 1E).
- Lasciare crescere le cellule per 48 ore. Aspirare il terreno e fissare il 4% di paraformaldeide per l'immunocolorazione (Figura 1F).
- Eseguire la doppia colorazione in immunofluorescenza utilizzando marcatori neuron-specifici (ad es. beta III-tubulina) e glia-specifici (ad es. proteina acida fibrillare gliale/GFAP) (Figura 1G).
- Per la morfometria, utilizzare un microscopio a luce invertita dotato di una telecamera CCD in combinazione con un software automatizzato che consente la misurazione della densità dei neuriti (vedi Tabella).
- La densità neuritica delle colture neuronali viene misurata su 4-5 fotomicrografie rappresentative con ingrandimento 200x da 4 diverse regioni di crescita più densa su ciascun vetrino coprioggetti sovrapponendo una griglia di 50 μm x 50 μm e contando la densità delle fibre per quadrato misurata nelle fibre che si intersecano. L'escrescenza dei neuriti, il numero medio di rami per neurone, la lunghezza media dei rami e le dimensioni pericarionali possono essere misurati da 30 neuroni solitari selezionati casualmente da ciascun vetrino coprioggetti marcando i neuriti e i perikarya (Figura 1H).
