1. Preparazione della coltura cellulare e set-up sperimentale
- Mantenere le cellule tumorali del colon umano, HCT-116 come raccomandato dal fornitore, in monostrati in fiasche di coltura da 75 cm2 contenenti 10 ml di McCoy's 5a Medium Modified formulato, integrato con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di soluzione antibiotica antimicotica.
- Coltivare le cellule in un ambiente umidificato al 5% di CO2 a 37 °C fino alla confluenza del 70% con rinnovo del terreno ogni 2 o 3 giorni.
- Per ottenere l'effetto del fascio BNCT (ad esempio, fascio di neutroni più BPA) e BNCT nell'uccidere le cellule tumorali come particelle pesanti e per depositare la maggior parte della loro energia all'interno delle cellule tumorali contenenti boro, il giorno prima dell'irradiazione, aggiungere l'agente di somministrazione del boro al terreno di coltura cellulare, ad esempio 10BPA, 4-Borono-L-fenilalanina (10 μg 10B/mL, 0,925 mM finale) 12–16 ore (massimo assorbimento di boro) prima dell'irradiazione.
nota: Se si utilizza un'altra linea cellulare, per la quale non esistono dati nel caso dello studio BNCT, testare l'assorbimento del boro per ciascuna linea cellulare per ottenere una concentrazione ottimale di boro. Misurare l'assorbimento cellulare di BPA mediante spettroscopia di emissione ottica al plasma accoppiato induttivamente (ICP-OES) come eseguito dal gruppo Dagrosa.
- Dopo 12-16 ore di erogazione del boro, aspirare il terreno e lavare le celle con 10 mL di 1x PBS. Quindi tripsinizzare le cellule aggiungendo 2 mL di soluzione di tripsina-EDTA alle cellule e incubare per 5 minuti a 37 °C per migliorare il distacco delle cellule. Quando le cellule iniziano a staccarsi, arrestare l'azione della tripsina aggiungendo 10 ml di terreno completo.
- Aspirare la sospensione cellulare nella provetta da 15 mL e contare le cellule utilizzando un contatore di cellule automatizzato aggiungendo 10 μL di blu di tripano allo 0,4% a 10 μL di cellule, mescolare e aliquotare 10 μL su un vetrino di conteggio. Diluire la sospensione cellulare a una concentrazione di 1 x 106 cellule/mL di terreno. Aliquotare 1 mL di sospensione cellulare per crioprovetta.
- Preparare dosimetri termoluminescenti (TLD) per la misurazione delle dosi di raggi gamma e lamine d'oro per le fluenze neutroniche e collegare i TLD alle crioprovette o al pallone di coltura cellulare prima dell'irradiazione.
- Irradiare 1 x 106 cellule/mL con il fascio miscelato di neutroni al flusso di neutroni termici minimo raccomandato di 5,9 x 1011 (n/cm-2 min-1)4 in fiasche di coltura o criotubi a seconda delle capacità dell'impianto.
nota: Impostare il tempo di irradiazione prima di ottenere il flusso di neutroni raccomandato.
- Dopo l'irradiazione, seminare 1 mL di cellule irradiate (1 x 106 cellule/mL) su vetrini coprioggetto da 22 x 22 mm in piastre di Petri da 35 mm o piastre a 6 pozzetti, integrare con 2 mL di terreno richiesto. Incubare le cellule per un massimo di 3 ore a 37 °C in un ambiente umidificato con CO2 al 5% per consentirne l'adesione ai vetrini. Osservare di tanto in tanto l'attaccamento delle cellule al microscopio invertito con obiettivo 20x.
nota: Per le cellule HCT-116, la densità minima è di 600.000 cellule da seminare. Per un'ulteriore procedura di colorazione rapida, utilizzare vetrini da camera, ridurre di conseguenza la densità cellulare.
2. Fissazione delle cellule
- Dopo l'irradiazione e l'incubazione delle cellule, rimuovere il terreno dalle cellule attaccate e lavare le cellule una volta con 2,5 mL di PBS.
- Fissare le cellule con 1 mL di etanolo al 70% per 10 minuti a RT.
nota: In alternativa, utilizzare l'1%-3,7% di paraformaldeide (PFA) per il fissaggio come raccomandato in precedenza. Il protocollo è in pausa qui. Conservare le cellule fissate in etanolo in congelatore a -20°C per non più di qualche settimana per ulteriori analisi e colorazione in immunofluorescenza.
3. Permeabilizzazione delle cellule
- Dopo il fissaggio, rimuovere l'etanolo dalla piastra di Petri e lavare con 2,5 ml di 1x PBS.
nota: Non lasciare asciugare le celle tra le fasi di risciacquo.
- Aggiungere delicatamente 1 mL di Triton X-100/PBS allo 0,2% per coprire i vetrini coprioggetti con le cellule in piastre di Petri.
- Incubare per 5 minuti a RT.
- Lavare le cellule 3 volte con 2,5 ml di 1 PBS.
nota: Aumentare la percentuale di Triton X-100 nella PBS fino allo 0,5%, se necessario (più focolai rilevabili, a seconda della linea cellulare testata). Eseguire ulteriori lavaggi con PBST (PBS con 0,5% di interpolazione) per evitare legature non specifiche.
- Bloccare la fase di permeabilizzazione con 1 mL di BSA (Bovine Serum Fraction V albumina) al 2% diluita in PBS e incubare per un minimo di 30 minuti o 1 ora con BSA.
nota: Questo passaggio può essere omesso e dipende dal tipo di anticorpo utilizzato. In alternativa, utilizzare il 5% di FBS come consigliato.
4. Colorazione in immunofluorescenza
- Aggiungere la giusta quantità di anticorpi primari (Anti-ɣ-H2AX, Anti-DNA-PKcs e Anti-Rad52) diluiti in PBS con BSA (2% di albumina della frazione sierica bovina V) come raccomandato (vedere la Tabella 1 con le diluizioni raccomandate) (sono necessari 100 μl per campione).
| Anticorpi primari | funzione | Diluizione consigliata | Stoccaggio [°C] |
| Anti-ɣ-H2AX | rilevamento di DNA-DSB | 1:1000 (PBS-BSA) | 4 |
| Anti-DNA-PKcs | Rilevamento di RIF della proteina DNA-PKcs appartenente a NHEJ | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| Anti-Rad52 | rilevamento di RIF della proteina Rad52 appartenente a HRR | 1:200 (PBS-BSA) | -20 |
| Anticorpo secondario | | Al buio | |
| IgG FITC anti-topo | Fuochi ɣ-H2AX | 1:400 (PBS-BSA) | 4 |
| Capra Anti-Coniglio IgG H&L (Alexa Fluor 488) | per focolai di proteine di riparazione NHEJ e HRR | 1:500 (PBS-BSA) | -20 |
Tabella 1: Diluizioni raccomandate e note per l'uso degli anticorpi utilizzati nella sezione
- Coprire la capsula di Petri per mantenere l'umidità in una scatola di plastica con lignina idratata utilizzando acqua distillata e incubare per 30 minuti a 37 °C nell'incubatrice.
nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. L'incubazione può essere eseguita a 4 °C durante la notte.
- Dopo l'incubazione, eseguire 3 lavaggi con 2,5 mL di PBS.
nota: Non lasciare asciugare lo scivolo durante le fasi di risciacquo.
- Aggiungere la giusta quantità di anticorpi secondari (IgG FITC anti-topo, IgG anti-coniglio di capra (Alexa Fluor 488) diluiti in PBS con BSA (vedi Tabella 1) (sono necessari 100 μl per campione). Per questo e per i passaggi successivi, lavora al buio.
- Coprire nuovamente la capsula di Petri per mantenere l'umidità in una scatola di plastica con lignina idratata e incubare per almeno 30 minuti a 37 °C nell'incubatrice.
- Dopo l'incubazione, eseguire 3 lavaggi con 2,5 ml di PBS.
- Aggiungere 100 μL di DAPI diluito in PBS a una concentrazione finale di 1 μg/mL per controcolorare i nuclei.
- Incubare brevemente per un massimo di 2 minuti a RT.
- Dopo l'incubazione, eseguire 3 lavaggi con 2,5 ml di PBS.
- Rimuovere il PBS e applicare delicatamente un vetrino coprioggetti sulla parte superiore del supporto di montaggio, evitando la formazione di bolle d'aria, e sigillare i bordi del vetrino coprioggetti con smalto per unghie. Aspetta che la vernice si asciughi e dipingi il vetrino coprioggetti.
- Attendere l'indurimento del mezzo di montaggio (fino a 3 ore) prima dell'analisi delle immagini al microscopio a fluorescenza.
nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Conservare i vetrini in una scatola di plastica a 4 °C al buio.
