Rilevamento di ROS con colorazione DCFH-DA: misurazione dei ROS totali nelle linee cellulari di cancro del colon-retto

Abstract

Fonte: Kim, H., et al. Rilevamento di specie reattive totali dell'ossigeno in cellule aderenti mediante colorazione con diacetato di 2',7'-diclorodiidrofluoresceina. J. Vis. Exp. (2020).

Questo video descrive il protocollo per la rilevazione delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) cellulari totali utilizzando il diacetato di 2',7'-diclorodiidrofluoresceina (DCFH-DA). Questo metodo aiuta a visualizzare la localizzazione dei ROS nelle cellule aderenti utilizzando un microscopio a fluorescenza e a quantificare ulteriormente l'intensità dei ROS con un lettore di piastre a fluorescenza.

Protocollo

1. Semina cellulare

1. Seminare 2 x 10⁵ cellule di cancro colorettale HCT116 per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti e mantenere le cellule nel terreno Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco per una notte a 37 °C.
2. Sostituire il terreno di coltura con o senza 100 μM di solfato ferroso (FS) o 10 μM di doxorubicina (DOX) e incubare per 24 ore.

2. Preparazione della soluzione DCFH-DA

1. Sciogliere 4,85 mg di DCFH-DA in 1 mL di dimetilsolfossido (DMSO) per ottenere una soluzione madre da 10 mM.
2. Diluire la soluzione madre con DMEM preriscaldato in una soluzione di lavoro da 10 μM subito prima di aggiungerla ai pozzetti.
3. Vortex la soluzione di lavoro per 10 s.

3. Colorazione DCFH-DA

1. Rimuovere il terreno contenente il farmaco e lavare una volta con DMEM.
2. Aggiungere 500 μl della soluzione di lavoro DCFH-DA in ciascun pozzetto e incubare a 37 °C per 30 minuti.
3. Rimuovere la soluzione di lavoro DCFH-DA. Lavare una volta con DMEM e 2 volte con 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
4. Aggiungere 500 μl di 1x PBS a ciascun pozzetto.

4. Acquisizione di immagini e misurazione dell'intensità

1. Acquisisci immagini fluorescenti rappresentative per ogni pozzetto utilizzando il canale della proteina fluorescente verde (GFP) su un microscopio a fluorescenza.
2. Dopo aver acquisito le immagini, rimuovere il PBS e aggiungere 200 μl di tampone per il saggio di radioimmunoprecipitazione (RIPA) a ciascun pozzetto.
3. Incubare con ghiaccio per 5 minuti, quindi raccogliere il lisato cellulare in provette da 1,5 mL.
4. Centrifugare a 21.130 x g per 10 min a 4 °C.
5. Trasferire 100 μl di surnatante su una piastra nera a 96 pozzetti e misurare l'intensità della fluorescenza utilizzando un lettore di micropiastre a fluorescenza a una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 530 nm.
6. Trasferire 1 μL di surnatante in una piastra trasparente a 96 pozzetti contenente 100 μL di soluzione per il saggio delle proteine 1x per misurare la concentrazione proteica utilizzando il test Bradford.
7. Normalizza le intensità di fluorescenza con le concentrazioni proteiche.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2',7'-diclorofluoresceina diacetato	Cayman Chemical, Ann Arbor, MI	Codice 20656
Doxorubicina cloridrato	TCI America, Portland, OR	D4193-25MG
Aquila di Dulbecco modificata media	Corning, Corning, NY	45000-304
Sistema di imaging automatico Invitrogen EVOS FL	Thermo Fisher Scientific Waltham, MA	AMAFD1000	o qualsiasi altro microscopio a fluorescenza
Saggio delle proteine Soluzione di Bradford	Bio-Rad, Hercules, CA	5000001
Lettore di micropiastre SpectraMax M2	Dispositivi molecolari, Radnor, PA	Codice 89429-532	o qualsiasi altro lettore di micropiastre a fluorescenza
Solfato ferroso eptaidrato	VWR, Radnor, PA	Codice 97061-542