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Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.
1. Coltura di linee cellulari
- Coltivare cellule HK in un terreno RPMI-1640 completo integrato con il 10% di siero fetale bovino, 2 nM di glutammina, 100 U/mL di penicillina G e 100 mg/mL di streptomicina a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2.
nota: Le cellule HK sono normali cellule dendritiche follicolari umane e possono essere coltivate ed espanse per ≤ 15 passaggi in vitro.
2. Marcatura e arricchimento dei tumori marcati con luciferasi
- Impiantare i tumori direttamente nel fianco sinistro e destro di topi femmina NOD/SCID di 6-8 settimane.
- Misura la crescita del tumore due volte alla settimana utilizzando un calibro digitale.
- A 1 cm di diametro, trasdurre il tumore. Iniettare direttamente nel tumore una singola dose di Luc/proteina fluorescente rossa (RFP)-lentivirus (50 μL/tumore, diluizione 1:30 da stock concentrato di lentivirus ad alto titolo) utilizzando una siringa da 1 cc con ago da 27 G.
nota: Il tumore del paziente raggiunge tipicamente 1 cm di diametro in 1-2 mesi. Tuttavia, il tasso di crescita è estremamente variabile e si basa su una serie di fattori, tra cui il grado e il tipo di tumore.
3. Modello murino CRC
- Anestetizzare un topo maschio NOD/SCID di sei-otto settimane con isoflurano (2,5% in ossigeno al 100%, 1 L/min) nella camera di induzione. Confermare la sedazione con un pizzico di punta.
- Posizionare il topo anestetizzato in posizione supina sotto un microscopio da dissezione, assicurandosi di fissare il muso a un cono nasale di isoflurano e gli arti anteriori con del nastro adesivo per la stabilità.
nota: Le lenti di ingrandimento possono essere utilizzate al posto di un microscopio da dissezione. Un piccolo oggetto può essere utilizzato per migliorare la visibilità e l'angolazione quando viene posizionato sotto la base della coda, sollevando l'ano. In genere, piccole sezioni di garza vengono arrotolate in una forma cilindrica di 1 pollice di diametro.
- Dilatare il canale anale con una pinza curva lubrificata a punta smussata per esporre la mucosa anale e rettale distale. Rimuovi le feci.
- Utilizzare un ago rimovibile sterile da 30 G su una siringa di vetro da 50 μL per iniettare 10 μL di cellule tumorali marcate con luciferasi e cellule HK (risospendere 10 μL di cellule tumorali per topo per il modello CRC in terreno RPMI completo) nella sottomucosa rettale posteriore distale, da 1 a 2 mm sopra il canale anale. Lo smusso dell'ago deve essere coperto dalla mucosa. Fare attenzione a non passare nella cavità pelvica.
- Rimuovere il mouse dal cono dell'isoflurano. Osservarlo per 1 ora dopo la procedura. Cerca segni di angoscia, ad esempio schiena curva, respiro affannoso, ecc.
4. Imaging bioluminescente
- Monitorare settimanalmente il carico metastatico primario del tumore, del fegato e del polmone utilizzando un sistema di imaging bioluminescente per l'attività della luciferasi.
- Ottenere un esperimento di CRC su topo e pesare. Iniettare 150 mg/kg di luciferina per via intraperitoneale e attendere 5 minuti affinché il substrato circoli nel corpo del topo.
- Anestetizzare il topo con isoflurano al 2,5% in ossigeno al 100%, 1 L/min nella camera di induzione.
- Posizionare il mouse in una macchina BLI Imaging con il naso fissato nel cono del naso. Durante l'esposizione per l'immagine, assicurarsi che l'area di interesse sia rivolta verso la fotocamera. Per l'iniezione di CRC, il lato ventrale deve essere rivolto verso la telecamera per ogni immagine. Immagina il mouse in posizione supina.