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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. La preparazione di huA33-TCO
NOTA: La sintesi di huA33-TCO è stata precedentemente riportata. Tuttavia, per comodità del lettore, qui viene replicato con regolazioni per condizioni ottimali.
- In una provetta da microcentrifuga da 1,7 mL, preparare una soluzione da 125 μL di (E)-cicloott-4-enile 2,5-diosso-1-pirrolidinil carbonato (TCO-NHS) in dimetilformammide secca (DMF) a una concentrazione di 40 mg/mL (0,15 M). Questa soluzione può essere aliquotata e congelata a -80 °C per essere utilizzata in esperimenti futuri.
- In una provetta da microcentrifuga separata da 1,7 mL, preparare una soluzione da 5 mg/mL di huA33 in 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS; 2,7 mM di cloruro di potassio, 137 mM di cloruro di sodio e 11,9 mM di fosfato di potassio, pH 7,4).
- Utilizzando piccole aliquote (<5 μL) di 0,1 M Na2CO3, regolare il pH della soluzione anticorpale dal passaggio 1,2 a 8,8-9,0. Utilizzare carta pH o un pHmetro con un microelettrodo per monitorare il pH e fare attenzione che il pH non superi 9,0.
- Alla soluzione anticorpale descritta al passaggio 1.3, aggiungere lentamente un volume corrispondente a 40 molari equivalenti di TCO-NHS rispetto alla quantità di anticorpo. Ad esempio, se nella soluzione sono presenti 5 mg (30 nmol) di huA33, aggiungere 9,0 μL (1,20 μmol) della soluzione da 40 mg/mL (0,15 M) di TCO-NHS.
nota: Il TCO-NHS è idrofobo. Quando lo si aggiunge alla soluzione anticorpale, aggiungerlo lentamente e agitando per evitare la precipitazione. Non superare il 10% di DMF in volume nella soluzione di reazione finale.
- Lasciare incubare la reazione a 25 °C su un termomiscelatore per 1 ora con una leggera agitazione (500 giri/min).
- Dopo 1 ora, purificare l'immunoconiugato huA33-TCO utilizzando una colonna di desalinizzazione monouso ad esclusione dimensionale preconfezionata.
- Equilibrare la colonna di esclusione dimensionale come descritto dal fornitore per rimuovere eventuali conservanti presenti nella colonna durante lo stoccaggio. Una procedura tipica prevede il lavaggio della colonna 5 volte con un volume di PBS che corrisponde al volume della colonna: 5 x 2,5 mL di PBS.
- Aggiungere la miscela di reazione alla colonna di esclusione dimensionale annotando il volume della miscela di reazione.
- Dopo che la miscela di reazione è entrata nella colonna, aggiungere una quantità appropriata di PBS per portare il volume totale di soluzione aggiunta alla colonna fino a 2,5 mL. Ad esempio, se la reazione di coniugazione ha prodotto un volume totale di 1,3 mL, aggiungere 1,2 mL di PBS aggiuntivo alla colonna.
- Prelevare il prodotto utilizzando 2 ml di PBS come eluente.
nota: Questo passaggio produrrà il costrutto finale huA33-TCO in 2 mL di PBS, pH 7,4.
- Misura la concentrazione di huA33-TCO utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis che monitora la lunghezza d'onda di 280 nm. Il coefficiente di estinzione molare per la maggior parte delle IgG (ε280) è 210.000 M-1 cm-1.
- Se si desidera una soluzione con una concentrazione più elevata di immunoconiugato, concentrare la soluzione huA33-TCO utilizzando un'unità di filtro centrifugo con un cut-off di 50.000 pesi molecolari seguendo le istruzioni del produttore.
nota: È noto che molti anticorpi si aggregano o precipitano durante la concentrazione. Quando tentano questa procedura con un nuovo anticorpo, i ricercatori dovrebbero fare riferimento alla letteratura o alla propria esperienza nella gestione dell'anticorpo in questione.
- Conservare l'immunoconiugato huA33-TCO completato a 4 °C al buio se è necessario immediatamente. Se in futuro deve essere utilizzato per più di 4 giorni, conservarlo a -80 °C al buio.
nota: Si tratta di un punto di arresto accettabile nella procedura. L'immunoconiugato huA33-TCO completato deve essere stabile per almeno 6 mesi di conservazione a -80 °C al buio.
2. La sintesi di Tz-PEG 7-NHBoc
- In una provetta da microcentrifuga da 1,7 mL, sciogliere 5 mg di tetrazina N-idrossisuccinimidil estere (Tz-NHS; 12,6 μmol) in 0,15 mL di dimetilsolfossido anidro (DMSO).
- In una provetta da microcentrifuga separata da 1,7 mL, sciogliere 8 mg del polimero ammino-protetto PEG, O-(2-Amminoetil)-O'-[2-(Boc-ammino)etil]esaetilenglicole (NHBoc-PEG7-NH2; 17,1 μmol) in 0,15 mL di DMSO anidro.
- Alla soluzione di Tz-NHS, aggiungere 3 μl (21,3 μmol, equivalenti 1,7 molari) di trietilammina (TEA) e mescolare accuratamente.
- Aggiungere la soluzione di tetrazina rosa alla soluzione NHBoc-PEG7-NH 2 del passaggio 2.2 e incubare la miscela di reazione per 30 minuti a temperatura ambiente (RT) con una leggera agitazione.
- Dopo 30 minuti, diluire la miscela di reazione 1:1 in H2O e purificarla utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) C18 in fase inversa per separare qualsiasi Tz-NHS non reagito dal Tz-PEG 7-NHBoc. Utilizzare solventi senza acido per evitare la rimozione prematura del gruppo protettivo Boc. Monitora sia Tz-PEG 7-NHBoc che Tz-NHS a una lunghezza d'onda di 525 nm.
nota: I tempi di ritenzione dipendono fortemente dalle apparecchiature HPLC di ciascun laboratorio (pompe, colonne, tubi, ecc.) e devono essere eseguiti controlli appropriati prima della purificazione. Tuttavia, per presentare un esempio, se si utilizza un gradiente da 5:95 MeCN/H2O (entrambi senza alcun additivo) a 95:5 MeCN/H2O in 30 min, una velocità di flusso di 1 mL/min e una colonna analitica C18 da 4,6 mm x 250 mm, i tempi di ritenzione di Tz-NHS e Tz-PEG 7-NHBoc sono di circa 16 min e 18 min, rispettivamente.
- Congelare l'eluente HPLC raccolto utilizzando azoto liquido e avvolgere la provetta di raccolta, ora congelata, in un foglio di alluminio. Posizionare la provetta di raccolta congelata su un liofilizzatore durante la notte per rimuovere la fase mobile HPLC. Il prodotto sarà un caratteristico tinta unita rosa brillante.
nota: Se l'azoto liquido non è disponibile, congelare l'eluente HPLC raccolto in ghiaccio secco o per una notte in un congelatore a -80 °C.
3. La sintesi di Tz-PEG7-NH 2
- Al prodotto della fase 2.6, Tz-PEG 7-NHBoc, aggiungere 1,5 mL di diclorometano (DCM) e trasferire questa soluzione in un piccolo pallone a fondo tondo.
- Aggiungere 0,25 mL di acido trifluoroacetico (TFA) goccia per goccia alla soluzione rosa del passaggio 3.1.
- Lasciare incubare la reazione per 30 minuti a RT con una leggera agitazione.
- Dopo 30 minuti, far evaporare il solvente tramite evaporazione rotativa. Non superare la temperatura del bagnomaria di 37 °C.
- Ricostituire il prodotto viscoso rosa in 0,5 ml di acqua.
- Purificare il prodotto utilizzando l'HPLC C18 in fase inversa per separare Tz-PEG7-NH 2 dal precursore protetto da Boc. Monitora sia Tz-PEG 7-NHBoc che Tz-PEG7-NH 2 a una lunghezza d'onda di 525 nm.
nota: I tempi di ritenzione dipendono fortemente dalle apparecchiature HPLC di ciascun laboratorio (pompe, colonne, tubi, ecc.) e devono essere eseguiti controlli appropriati prima della purificazione. Tuttavia, per presentare un esempio, se si utilizza un gradiente da 5:95 MeCN/H2O (entrambi con TFA dello 0,1%) a 95:5 MeCN/H2O in 30 min, una velocità di flusso di 1 mL/min e una colonna analitica C18 da 4,6 mm x 250 mm, i tempi di ritenzione di Tz-PEG 7-NHBoc e Tz-PEG7-NH 2 sono di circa 18 min e 13 min, rispettivamente.
- Congelare l'eluente HPLC raccolto utilizzando azoto liquido e avvolgere la provetta di raccolta, ora congelata, in un foglio di alluminio. Posizionare la provetta di raccolta congelata su un liofilizzatore durante la notte per rimuovere la fase mobile HPLC. Il prodotto sarà un solido rosa brillante.
- Ricostituire il prodotto dal passaggio 3.7, Tz-PEG7-NH 2, con 150 μl di DMSO e trasferire in una provetta per microcentrifuga da 1,7 mL.
- Misurare la concentrazione di Tz-PEG7-NH 2 utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis che monitora la lunghezza d'onda di 525 nm. Il coefficiente di estinzione molare per Tz-PEG7-NH 2 (ε525) è 535 M-1 cm-1.
4. La sintesi di Tz-PEG7-DOTA
- Sciogliere Tz-PEG7-NH 2 (4,5 mg, 6,9 μmol) in 0,15 mL di DMSO (o procedere con la soluzione creata al punto 3.8).
- Aggiungere 22 equivalenti molari di TEA (21 μL, 0,15 mmol) alla soluzione contenente tetrazina del passaggio 4.1.
- Aggiungere 10 mg (14,2 μmol) di p-SCN-Bn-DOTA come solido e agitare la soluzione per circa 2 minuti o fino a quando il materiale non è completamente disciolto.
- Lasciare incubare la reazione per 30 minuti a RT con una leggera agitazione.
- Dopo 30 minuti, diluire la reazione 1:1 in H2O e purificare il prodotto utilizzando l'HPLC C18 in fase inversa per rimuovere il p-SCN-Bn-DOTA non reagito. Il p-SCN-Bn-DOTA può essere monitorato a una lunghezza d'onda di 254 nm, mentre il Tz-PEG7-DOTA è meglio monitorato a una lunghezza d'onda di 525 nm.
nota: I tempi di ritenzione dipendono ovviamente in larga misura dalle apparecchiature HPLC di ciascun laboratorio (pompe, colonne, tubazioni, ecc.) e prima della purificazione è necessario eseguire controlli appropriati. Tuttavia, per presentare un esempio, se si utilizza un gradiente da 5:95 MeCN/H2O (entrambi con TFA dello 0,1%) a 95:5 MeCN/H2O in 30 min e una colonna C18 analitica da 4,6 x 250 mm, Tz-PEG7-DOTA e p-SCN-Bn-DOTA hanno tempi di ritenzione rispettivamente di circa 15,6 min e 16,1 min.
- Congelare l'eluente HPLC raccolto utilizzando azoto liquido e avvolgere la provetta di raccolta, ora congelata, in un foglio di alluminio. Posizionare la provetta di raccolta congelata su un liofilizzatore durante la notte per rimuovere la fase mobile HPLC. Il prodotto sarà una polvere rosa brillante.
- Ricostituire il prodotto in 0,15 mL di DMSO e misurare la concentrazione utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis che monitora la lunghezza d'onda di 525 nm. Il coefficiente di estinzione molare per Tz-PEG7-DOTA (ε525) è 535 M-1 cm-1.
- Analizzare il composto finale mediante risonanza magnetica nucleare (NMR) e spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS) per verificare che la sintesi abbia avuto successo. Si veda la Tabella 1 per gli spostamenti chimici e i pesi molecolari determinati sperimentalmente di tutti i composti discussi in questo lavoro.
- Conservare la soluzione purificata di Tz-PEG7-DOTA al buio a -80 °C.
nota: Si tratta di un punto di arresto accettabile nella procedura. Il precursore Tz-PEG7-DOTA completato è stabile per almeno 1 anno in queste condizioni.
5. 177Lu Radiomarcatura di Tz-PEG7-DOTA
ATTENZIONE: Questa fase del protocollo prevede la manipolazione e la manipolazione della radioattività. Prima di eseguire questi passaggi – o eseguire qualsiasi altro lavoro con la radioattività – i ricercatori dovrebbero consultare il Dipartimento di Sicurezza delle Radiazioni della loro istituzione di origine. Adottare tutte le misure possibili per ridurre al minimo l'esposizione alle radiazioni ionizzanti.
NOTA: Quando si lavora con piccole quantità di radiometalli, si raccomanda che tutti i tamponi siano privi di tracce di metalli per evitare interferenze nel legame del sito di coordinazione.
- In una provetta da centrifuga da 1,7 mL, aggiungere 200 μl di tampone acetato di ammonio 0,25 M regolato con aliquote di 1 M HCl a pH 5,5,
nota: Se si utilizzano meno di 370 MBq di attività per la marcatura, il volume di tampone utilizzato deve essere ridotto a 100 μL.
- Aggiungere la quantità desiderata di [177Lu]LuCl3 alla soluzione tampone. La quantità aggiunta dipenderà dal numero di soggetti nell'esperimento e dalle dosi radioattive somministrate. Si raccomanda di aggiungere 1-2 dosi extra di radioattività come precauzione per compensare la potenziale perdita di radioattività durante le fasi di purificazione.
- Aggiungere Tz-PEG7-DOTA in DMSO alla miscela radioattiva al punto 5.2. La quantità di Tz-PEG7-DOTA dipende dal numero di soggetti testati. Per ulteriori informazioni su questo argomento, vedere il passaggio 6.2.2.2.
- Lasciare incubare la soluzione a 37 °C per 20 minuti.
- Verificare che la marcatura radio sia completa utilizzando la cromatografia istantanea su strato sottile (radio-iTLC) con EDTA 50 mM, pH 5,5 come fase mobile. Il [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz marcato rimarrà al basale - Rf = 0 - mentre il [177Lu]Lu3+ libero sarà coordinato dall'EDTA e viaggerà con il fronte del solvente, Rf = 1,0 (Figura 1B).
- Se la marcatura quantitativa non viene raggiunta, aggiungere leganti per coordinare il radiometallo libero. In alternativa, purificare il [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz etichettato utilizzando una cartuccia C18. Seguire le istruzioni per l'uso del produttore. Di seguito viene fornito un esempio di procedura.
- Adescare la cartuccia facendo passare lentamente 5 mL di etanolo attraverso la cartuccia con una siringa grande. Quindi, passare attraverso 5 mL di acetonitrile e poi 5 mL di H2O deionizzato (DI).
- Aspirare la soluzione di radioligando dal punto 5.3 in una siringa più piccola e iniettarla lentamente sulla cartuccia di C18. Quindi, lavare la cartuccia con 10 mL di DI H2O per rimuovere eventuali [177Lu]LuCl3 non legati.
- Eluire con 500 μL di etanolo. Rimuovere l'etanolo dal prodotto finale passandolo sopra il recipiente con una bassa portata di azoto secco o argon per 10-15 minuti. Successivamente, risospendere il radioligando in soluzione salina in un volume determinato al punto 6.2.2.2.
6. Studi in vivo
ATTENZIONE: Come nella Sezione 5, questa fase del protocollo comporta la manipolazione e la manipolazione della radioattività. Prima di eseguire questi passaggi, i ricercatori dovrebbero consultare il Dipartimento di Sicurezza Radiologica della loro istituzione di origine. Adottare tutte le misure possibili per ridurre al minimo l'esposizione alle radiazioni ionizzanti.
- Preparazione degli animali
- Nei topi nudi amimici femmine, impiantare per via sottocutanea 5 x 106 cellule di cancro colorettale SW1222 sospese in 150 μL di una miscela 1:1 di mezzi cellulari e matrice (ad esempio, Matrigel) e lasciarle crescere in uno xenotrapianto di 100-150 mm3 (14-18 giorni dopo l'inoculazione).
- Selezione degli animali per un esperimento di biodistribuzione
- Una volta che i tumori sono di dimensioni sufficienti, come determinato dalla misurazione del calibro, smistare gli animali per garantire che ogni coorte abbia approssimativamente lo stesso volume medio del tumore. Gli animali possono essere distinti in ogni gabbia da segni sulla coda con inchiostro indelebile (una fascia, due fasce, ecc.).
- Selezione di animali per uno studio di terapia longitudinale
- Una volta che i tumori sono di dimensioni sufficienti, come determinato dalla misurazione del calibro, attaccare i marchi auricolari a ciascuno degli animali per garantire il corretto tracciamento durante l'esperimento><.
nota: I marchi auricolari numerici possono cadere durante l'esperimento. Di conseguenza, si consiglia di accompagnare questi tag fisici con tacche auricolari in modo sistematico (ad esempio, destra, sinistra, bilaterale, destra x 2, sinistra x 2).
- Ordina gli animali in modo che il volume medio del tumore in ciascuna coorte sia più o meno uguale. Il seguente metodo per lo smistamento degli animali può essere eseguito utilizzando un programma per fogli di calcolo.
- Elenca i numeri di identificazione degli animali, il modello di tacca dell'orecchio e il volume del tumore in tre colonne separate.
- Ordina i dati dal volume tumorale più piccolo a quello più grande.
- In una quarta colonna, assegna a ciascun animale un numero di gabbia e passa da una gabbia all'altra in uno schema simile a un serpente. Ad esempio, se ci sono 5 gabbie, questa colonna verrebbe riempita "5, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 5..." fino a quando a tutti gli animali non viene assegnata una gabbia.
- Una volta assegnate le gabbie, ordina i dati in base al numero di gabbia. Se si utilizzano tacche per le orecchie, assicurarsi che ogni animale in una determinata gabbia abbia un modello di tacca per le orecchie unico. Se ci sono duplicati (due o più dello stesso modello) in una determinata gabbia, scambia un topo con uno di un'altra gabbia con il modello mancante fino a quando ogni gabbia non avrà animali con modelli unici di tacca per le orecchie.
- Formulazioni e Iniezioni
nota: La sequenza di iniezione sia per la biodistribuzione che per lo studio della terapia procede come segue: huA33-TCO viene iniettato per primo, seguito da [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz dopo un intervallo predeterminato.
- Immunoconiugato
- Diluire un'aliquota della soluzione di huA33-TCO dallo Step 1.9 a una concentrazione di 0,8 mg/mL in soluzione salina sterile allo 0,9%.
- Prelevare dosi di 150 μL (100 μg) di soluzione di huA33-TCO in siringhe pretrattate con albumina sierica bovina (BSA) all'1% in PBS e conservare queste siringhe su ghiaccio.
nota: Il trattamento con BSA riduce il legame aspecifico dell'anticorpo alle pareti della siringa.
- Scaldare l'animale sotto una lampada riscaldante per 3 minuti per dilatare la vena caudale.
- Iniettare la soluzione di huA33-TCO nella vena caudale del topo portatore di xenotrapianto. Attendere 24 ore (o un diverso intervallo di tempo predeterminato) affinché l'huA33-TCO si accumuli nel tumore del topo.
- Radioligando
- Radiomarcatore Tz-PEG7-DOTA come indicato nella Sezione 5.
- Prelevare dosi in 150 μl di soluzione fisiologica sterile allo 0,9% contenente equivalenti molari di 1,1 molari di Tz-PEG7-DOTA rispetto alla quantità di huA33-TCO somministrata. Ad esempio, se 100 μg (0,67 nmol) di huA33-TCO sono stati iniettati nell'animale e la miscela di reazione [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz è stata prodotta con un'attività specifica di 12,4 GBq/μmol, verranno prelevate dosi contenenti 9,14 MBq di attività ciascuna. Ciò corrisponde a 0,74 nmol di Tz (1,1 eq. molare rispetto a huA33-TCO).
- Scaldare gli animali sotto una lampada riscaldante per 3 minuti per dilatare la vena caudale.
- Iniettare la dose di radioligando nella vena caudale del topo portatore di xenotrapianto. La quantità di attività da iniettare è determinata dal ricercatore. I dati pubblicati hanno mostrato effetti terapeutici dose-dipendenti sulle dimensioni del tumore in un intervallo compreso tra 7,4 e 55,5 MBq.
