Estrazione di miRNA circolanti: un metodo per isolare i miRNA da campioni di plasma tramite estrazione organica e arricchimento di piccoli RNA

Abstract

Fonte: Canale, M. et al., Rilevamento di un pannello personalizzato di microRNA circolante in pazienti con carcinoma colorettale metastatico. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video descrive l'estrazione di microRNA circolanti da campioni di plasma di pazienti con cancro del colon-retto utilizzando l'estrazione organica seguita dall'arricchimento della colonna in fibra di vetro. I miRNA sono stabili nei fluidi biologici come il siero e il plasma, il che li rende biomarcatori circolanti ideali per la diagnosi del cancro, la prognosi e il processo decisionale e il monitoraggio del trattamento. Questo metodo aiuterà a identificare nuovi biomarcatori circolanti in grado di prevedere gli esiti clinici nei pazienti.

Protocol

NOTA: Eseguire tutti i seguenti passaggi sotto una cappa sterilizzata secondo la Buona Pratica di Laboratorio (GLP).

1. Raccolta e conservazione del plasma

1. Raccogliere 3 mL di campione di sangue periferico in una provetta K3E EDTA.
2. Centrifugare la provetta a temperatura ambiente a 1,880 x g per 15 minuti.
3. Recuperare il plasma surnatante in aliquote di 450 μL.
4. Conservare i campioni a -80 °C fino al momento dell'uso.
   NOTA: Processare la provetta di sangue periferico entro 2 ore dal prelievo. Durante il recupero del plasma dalla provetta, non disturbare lo strato linfocitario.

2. Estrazione di miRNA circolanti da campioni di plasma

1. Preparare tutte le soluzioni necessarie e scongelare i campioni per le fasi di estrazione.
   1. Aggiungere 375 μl di 2-mercaptoetanolo alla soluzione denaturante 2x e mescolare bene.
   2. Aggiungere 21 mL di etanolo al 100% di grado ACS alla soluzione di lavaggio miRNA I e mescolare bene.
   3. Aggiungere 40 mL di etanolo al 100% di grado ACS alla soluzione di lavaggio 2/3 e mescolare bene.
   4. Lasciare scongelare un'aliquota di plasma a temperatura ambiente e quindi iniziare le fasi di estrazione.

2. Estrazione organica
   1. Trasferire 400 μl del campione di plasma in una provetta da 2 mL priva di RNasi.
   2. Aggiungere 400 μl di soluzione denaturante 2x, mescolare a vortice e centrifugare brevemente.
   3. Aggiungere 4 μl di spike-in da 1 nM, mescolare a vortice e centrifugare brevemente.
   4. Aggiungere 800 μl di fenolo-cloroformio acido.
   5. Agitare per 60 s e centrifugare alla massima velocità (≥10.000 x g) per 15 minuti.
   6. Trasferire la fase acquosa superiore in una provetta nuova. Non disturbare l'interfase. Annotare il volume recuperato e gettare la provetta contenente la fase non acquosa.
      nota: La soluzione denaturante 2x viene conservata a 4 °C e può solidificare a questa temperatura. Prima dell'uso, riscaldare la soluzione a 37 °C, agitando di tanto in tanto per 10-15 minuti. Fare attenzione a prelevare la fase inferiore contenente l'acido fenolo-cloroformio, non il tampone acquoso che si trova sopra la miscela. Preriscaldare la soluzione di eluizione o l'acqua priva di nucleasi a 95 °C. Fare attenzione a riscaldare un volume adeguato di soluzione (100 μl per campione + 10% in eccesso).

3. Arricchimento di piccoli RNA
   1. Aggiungere 1/3 del volume di etanolo al 100% alla fase acquosa del passaggio 2.2.6 e mescolare accuratamente.
   2. Inserire una cartuccia filtrante in una nuova provetta di raccolta per ogni campione.
   3. Trasferire fino a 700 μl di lisato dalla fase 2.3.1 ed etanolo nella cartuccia filtrante e centrifugare a 10.000 x g per 30 s.
   4. Se rimangono >700 μl di miscela, posizionare il filtrato in una provetta nuova e ripetere il passaggio 2.3.3; ripetere fino a quando l'intera miscela non è passata attraverso la cartuccia filtrante.
   5. Misurare il volume totale del flusso.
   6. Aggiungere 2/3 del volume di etanolo al 100% per filtrare e mescolare accuratamente.
   7. Mettere una seconda cartuccia filtrante in una nuova provetta di raccolta.
   8. Trasferire fino a 700 μl di volume di campione nella cartuccia e centrifugare a 10.000 x g per 30 s. Scartare il flusso.
   9. Ripetere il passaggio 1.3.8 fino a quando tutta la miscela non è passata attraverso la cartuccia del filtro.
   10. Applicare 700 μl di soluzione di lavaggio miRNA 1 sulla cartuccia filtrante e centrifugare la cartuccia filtrante con la provetta di raccolta a 10.000 x g per 15 s. Scartare il flusso. Posizionare la cartuccia del filtro nella stessa provetta di raccolta.
   11. Applicare 500 μl di soluzione di lavaggio 2/3 sulla cartuccia filtrante e centrifugare la cartuccia filtrante con la provetta di raccolta a 10.000 x g per 15 s. Scartare il flusso. Mettere la cartuccia del filtro in una nuova provetta di raccolta.
   12. Posizionare la cartuccia filtrante in una provetta di raccolta nuova e ripetere il passaggio 2.3.11 con 500 μl di soluzione di lavaggio 2/3. Eliminare il flusso e trasferire la cartuccia filtrante in una nuova provetta di raccolta.
   13. Centrifugare le provette con le cartucce filtranti a 10.000 x g per 1 min.
   14. Trasferire la cartuccia del filtro in una provetta di raccolta fresca da 1,5 mL e aggiungere 100 μL di soluzione di eluizione preriscaldata (95 °C) o acqua priva di nucleasi.
   15. Centrifugare a 10.000 x g per 30 s per recuperare i miRNA e conservarli a -80 °C.
       nota: Nella soluzione di lavaggio 2/3 può formarsi un precipitato bianco. Questo precipitato è l'eccesso di EDTA rilasciato dalla soluzione. Evitare di aspirare questi cristalli durante le fasi di pipettaggio.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provette da 1,5 mL Safe-lock senza RNAsi	Eppendorf	Codice 0030 123.328
Puntali da 1000 μL privi di RNASI	Laboratorio stellare	S1122-1830
Provette da 2 mL Safe-lock senza RNAsi	Eppendorf	Codice 0030 123.344
Puntali da 20 μL privi di RNASI	Laboratorio stellare	S1123-1810
Puntali da 200 μL privi di RNASI	Laboratorio stellare	S1120-8810
mirVana PARIS RNA e kit di purificazione delle proteine native	Thermo Fisher	AM1556
100% etanolo anidro grado ACS	Carlo Erba Reagenti	414605
2-mercaptoetanolo	Sigma-Aldrich	Codice: M3148
Pipette da laboratorio da 0,2-2, 1-10, 2-20, 20-200, 100-1000 μL
Cappa aspirante
Microcentrifuga da banco
vortice