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Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.
1. Isolamento del DNA genomico dalle feci
NOTA: Utilizza un kit commerciale per isolare il DNA microbico dalle feci seguendo un protocollo di rilevamento dei patogeni delle feci. Prelevare i campioni direttamente dal congelatore a -80 °C e conservarli su ghiaccio secco durante la pesatura.
- Trasferire fino a 220 mg di feci in una provetta per microfusa pulita contenente 1,4 mL di tampone per la lisi delle feci a temperatura ambiente (RT) (vedere la Tabella dei materiali).
- Campione a vortice per 1 minuto per omogeneizzare completamente i solidi (Figura 1B). Riscaldare la sospensione a 95 °C per 5 minuti per lisare tutti i batteri (compresi i batteri Gram-positivi).
- Campionare a vortice per 15 s e poi centrifugare a 20.000 x g per 1 minuto per pellettare i solidi delle feci. Trasferire il surnatante in una provetta microfuge da 2 mL. Aggiungere una compressa a ciascun campione per assorbire gli inibitori della PCR, agitare fino a quando la compressa non si è disciolta e incubare il campione a RT per 1 minuto.
- Centrifugare il campione a 20.000 x g per 3 minuti e trasferire il surnatante in una nuova provetta per microfuge. Centrifugare a 20.000 x g per 3 min. Aliquotare 15 μL di proteinasi K (20 mg/mL di riserva) in una nuova provetta per microfuge da 1,5 mL. Pipettare 200 μl del campione nella provetta contenente la proteinasi K.
- Aggiungere 200 μl di tampone di lisi di cloruro di guanidinio alla provetta, agitare accuratamente per 15 s (vedere la tabella dei materiali) e incubare il campione a 70 °C per 10 min. Aggiungere 200 μl di etanolo (96-100%) alle provette e mescolare bene agitando.
- Posizionare una colonna di centrifuga a base di silice in una provetta di raccolta da 2 mL e applicare i campioni sulla colonna. Chiudere il coperchio e centrifugare per 1 minuto a 20.000 x g.
- Trasferire la colonna in una nuova provetta di raccolta da 2 mL e aggiungere 500 μL di tampone di lavaggio 1 alla colonna, tappare la colonna e centrifugare per 1 minuto a 20.000 x g. Trasferire la colonna in una nuova provetta di raccolta da 2 mL e aggiungere 500 μL di tampone di lavaggio 2 alla colonna, Chiudere il tappo e centrifugare a 20.000 x g per 3 min.
- Con il tappo chiuso, trasferire la colonna in una nuova provetta di raccolta da 2 mL e centrifugare per un altro 1 minuto a 20.000 x g per rimuovere il tampone di lavaggio residuo. Trasferire la colonna in una provetta per microfuge marcata da 1,5 mL ed eluire il campione aggiungendo 200 μL di tampone di eluizione contenente EDTA alla membrana (vedere la Tabella dei materiali).
- Chiudere il tappo e incubare a RT per 1 minuto. Centrifugare il campione per 1 minuto a 20.000 x g. Scartare la colonna.
2. Determinazione della concentrazione di DNA e preparazione del campione per la PCR
NOTA: Utilizza un fluorimetro e un test fluorescente dsDNA disponibile in commercio per determinare la concentrazione di DNA genomico in ciascun campione (vedi Tabella dei materiali). Il colorante fluorescente deve legare specificamente il DNA a doppio filamento.
- Preparare una diluizione 1:200 di ciascun campione (1 μL di ciascun campione in 199 μL di dsDNA master mix) e una diluizione 1:50 degli standard. Analizza su un fluorimetro utilizzando l'impostazione dsDNA.
Nota: un volume elevato di DNA nella PCR può essere inibitorio, pertanto il volume di DNA utilizzato non deve essere superiore al 10% del volume finale della PCR. Un fluorimetro consente una misurazione accurata del DNA nel campione, poiché solo il DNA legato al colorante fluorescente emette fluorescenza, eliminando il possibile contributo dei contaminanti alla concentrazione finale di DNA calcolata. Questo livello di quantificazione accurata è essenziale per l'applicazione di sequenziamento a valle.
- Preparare maschere PCR diluite a 5 ng/μL con il volume appropriato di 10 mM Tris, pH 8,5 per creare maschere di lavoro di ciascun campione.
- Conservare i campioni a -20 °C.
3. Progetta i primer per le regioni V desiderate 16S
- Progettare primer per amplificare selettivamente le regioni desiderate dell'rRNA V 16S.
- Analizza i primer con Probe Match, dal Ribosomal Database Project, per determinare il tasso di successo approssimativo per vari phyla.
Nota: per le regioni V1-V3, l'attuale studio ha utilizzato i primer pubblicati Bosshard forward, che si lega alla posizione 8 all'interno della regione V1, e 533 reverse, che si lega alla posizione 533 all'interno della regione V3. Gli inneschi devono includere sequenze di adattatori a sbalzo per l'indicizzazione.
- Quando si progettano i primer, includere sequenze di adattatori alle estremità 5' di ciascun primer, come raccomandato per la preparazione della libreria di sequenziamento della metagenomica 16S (Tabella 1).
- Sintetizza questi inneschi di grandi dimensioni con la purificazione a cartuccia. Ricostituire i primer essiccati e diluire un working stock per PCR a 1 μM in 10 mM Tris, pH 8,5.
4. Amplicon PCR per amplificare la/e regione/e V con sequenze di adattatori a sbalzo collegate
- Impostare la miscela di reazione dell'amplicon PCR come descritto nella Tabella 2.
- Posizionare un sigillo adesivo trasparente per PCR sulla piastra ed eseguire l'amplicon PCR utilizzando i parametri nella Tabella 3.
- (Opzionale) Eseguire i prodotti della PCR con amplicicone su un gel di agarosio o su un test del DNA ad alta sensibilità che consente la misurazione quantitativa delle dimensioni dell'amplicone (vedere la Tabella dei materiali).
Nota: La dimensione dell'amplicone di questo studio è di 550 bp (Figura 2a).
5. Pulizia PCR con Perline Magnetiche
- Centrifugare rapidamente la piastra PCR dell'amplicone a 1.000 x g per 1 minuto per raccogliere la condensa.
nota: Le strisce di provette PCR possono essere utilizzate al posto delle piastre PCR per ridurre al minimo la contaminazione. Gettare i coperchi delle provette e non riutilizzarli mai.
- Agitare le microsfere magnetiche per disperderle uniformemente e aggiungere 20 μL di microsfere magnetiche a ciascun pozzetto PCR dell'amplicone, quindi pipettare l'intero volume su e giù lentamente 10 volte.
- Incubare a RT per 5 minuti. Posizionare la piastra PCR su un supporto magnetico per 2 minuti fino a quando le microsfere magnetiche non vengono raccolte e il surnatante è limpido. Rimuovere ed eliminare il surnatante.
- Lavare le perle con 200 μL di etanolo fresco all'80% mentre la piastra PCR si trova sul supporto magnetico e incubare per 30 s a RT sul supporto magnetico. Rimuovere con cautela il surnatante.
- Ripetere il lavaggio una seconda volta. A questo punto, utilizzare una punta di pipetta fine per rimuovere l'etanolo residuo dai pozzetti e lasciare asciugare all'aria per 10 minuti.
- Rimuovere la piastra PCR dal supporto magnetico e aggiungere 52,5 μl di 10 mM Tris pH 8,5 a ciascun pozzetto. Pipettare su e giù 10 volte per sospendere le perle e incubare a temperatura ambiente per 2 minuti.
- Trasferire la piastra PCR sul supporto magnetico per raccogliere le microsfere magnetiche e trasferire 50 μl di surnatante in una piastra PCR pulita. Posizionare un sigillo adesivo trasparente per PCR sulla piastra e conservare a -20 °C per un massimo di una settimana.
| Amplicon PCR Primers |
| inoltrare | 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGagagtttgatcMtggctcag-3' |
| inverso | 5'- GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTATAAGAGACAGTTACCGCGGCTGCTGGCAC -3' |
| Le sequenze specifiche del locus sono mostrate in grassetto e il non grassetto è la sequenza dell'adattatore a sbalzo. |
Tabella 1: Primer per PCR con amplicon.
| Configurazione della reazione di Amplicon PCR | |
| volume |
| DNA microbico (5ng/μl) | 2,5 μl |
| Primer diretto (1 μM; dal passaggio 3.1) | 5,0 μl |
| Reverse Primer (1 μM; dal passaggio 3.1) | 5,0 μl |
| 2X HotStart Ready Mix | 12,5 μl |
| totale | 25,0 μl |
Tabella 2: Primer per PCR con amplicon.
| Amplicon PCR impostato |
| 95 °C per 3 minuti | |
| 25 cicli di: | |
| 95 °C per 30 secondi |
| 55 °C per 30 secondi |
| 72 °C per 60 secondi |
| 72 °C per 3 minuti | |
| Mantenimento a 4 °C | |
Tabella 3: Impostazione del programma Amplicon PCR.
