Etichettatura delle cellule organoidi di organoidi CRC: un metodo per generare cellule organoidi di cancro colorettale trasdotte da lentivirus GFP

Abstract

Fonte: Okazawa Y. et al., Rilevamento ad alta sensibilità di micrometastasi generate da organoidi trasdotti da lentivirus GFP coltivati da un tumore del colon derivato da un paziente. (2018).

Questo video descrive la tecnica di generazione di organoidi CRC trasdotti da particelle lentivirali GFP per consentire l'imaging fluorescente. Questi organoidi marcati con GFP, quando inseriti in modelli animali, aiutano a studiare l'invasione e le metastasi tumorali.

Protocollo

1. Generazione degli organoidi CRC coltivati su matrice extracellulare artificiale

Le procedure sperimentali per la coltura di organoidi CRC dei PDX del colon sono descritte nella Figura 1B (passaggio 4).

1. Stabilire un terreno di coltura adatto per gli organoidi CRC derivati da PDX (vedere la Tabella dei materiali, "il terreno di coltura per organoidi CRC") utilizzando terreni precedentemente descritti per gli organoidi del colon umano.
2. Applicare 150 μL di matrice extracellulare artificiale (vedi Tabella dei materiali) per pozzetto su una piastra a 12 pozzetti su ghiaccio e poi incubarla per 30-60 minuti in un incubatore a 37 °C, CO₂ al 5% per solidificare i gel.
3. Sospendere il pellet cellulare di cellule CRC ottenute dal modello murino PDX con il terreno di coltura di organoidi CRC (dal passaggio 1.1) con FCS al 5% per regolare a 3 x 10⁵ cellule/mL. Quindi, seminare 1 mL di terreno sulla piastra artificiale rivestita di matrice extracellulare preparata nella fase 1.2 e incubare per una notte a 37 °C sotto il 5% di CO₂. Utilizzare un emocitometro per contare il numero di cellule tumorali, comprese le singole cellule e i cluster multicellulari (un gruppo di cellule aderenti) nella sospensione cellulare.
   NOTA: In questo studio viene utilizzato FCS al 5% per estinguere l'attività enzimatica residua della collagenasi.
4. Raccogliere con cura il terreno di coltura, comprese le cellule galleggianti staccate dalla piastra rivestita di matrice extracellulare artificiale, in una provetta da centrifuga da 1,5 ml il giorno successivo e centrifugarla a 1.400 x g per 5 minuti. Quindi, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 70 μL di matrice extracellulare artificiale su ghiaccio.
5. Per aumentare la vitalità delle cellule CRC, sovrapporre la matrice extracellulare artificiale contenente cellule tumorali sulle cellule organoidi tumorali attaccate alla piastra rivestita di matrice extracellulare artificiale e incubare per 30 minuti in un incubatore a 37 °C, CO₂ al 5% per solidificare il rivestimento della matrice extracellulare artificiale. Quindi, incubarlo con 1 mL di terreno di coltura cellulare organoide CRC con FCS all'1% a 37 °C sotto il 5% di CO₂.
6. Cambiare il terreno di coltura ogni due giorni. Poiché gli organoidi CRC riempiono il terreno, potrebbe essere necessario cambiare il terreno ogni giorno.

2. Generazione e arricchimento di particelle lentivirali GFP

Le procedure sperimentali per la generazione e l'arricchimento di particelle lentivirali GFP sono descritte nella Figura 1C (fase 5).

1. Coltivare HEK293T le cellule con il terreno 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) contenente il 10% di FCS e preparare sei piastre da 10 cm (2 x 10⁶ cellule per piastra) per la successiva procedura di trasfezione.
2. Per la trasfezione per piastra, preparare 500 μl della miscela di cui 20 μl del reagente di trasfezione in DMEM con un vettore PRRL-GFP (5 μg) e due plasmidi lentivirali, come pCMV-VSV-G (1 μg) e pCMV-dR8.2 dvpr (5 μg), in una microprovetta sterile da 1,5 mL. Mantenere il composto a temperatura ambiente per 20 minuti, quindi sovrapporlo su ciascuno dei piatti da 10 cm e incubarli per 18 ore.
3. Togliere il terreno, aggiungere 5 ml di terreno fresco al 10% FCS-RPMI 1640 in ogni piatto e lasciare riposare per 24 ore.
4. Raccogliere il terreno condizionato da ciascuna piastra in una provetta da centrifuga da 50 ml e conservare un totale di 30 ml di terreno a 4 °C per una notte. Aggiungere 5 ml di RPMI 1640 fresco su ogni piatto e lasciare riposare per 24 ore.
5. Raccogliere il terreno condizionato da ciascuna piastra in una provetta da centrifuga da 50 ml e conservare, in totale, 30 ml di terreno sul ghiaccio. Quindi, scartare le celle.
6. Filtrare 60 mL di terreno (dai passaggi 2,4-2,5) attraverso un filtro da 0,45 μm per rimuovere le cellule e dividere questa quantità in dodici provette da centrifuga in polipropilene da 5 mL per l'ultracentrifugazione.
7. Per concentrare i virus, centrifugarli utilizzando un rotore a secchiello oscillante a 85.327 x g per 1,5 ore a 4 °C.
8. Rimuovere immediatamente il mezzo. Per risolvere il pellet virale concentrato, posizionare 250 μl di Nutrient Ham's Mixture F-12 (F12)/DMEM medium senza FCS in ciascuna delle dodici provette e mantenerlo a 4 °C per una notte. Si noti che il pellet virale è spesso invisibile.
9. Pipettare delicatamente il terreno per raccogliere 3 mL del 19 °C concentrato 5x GFP lentivirus, in totale, presumibilmente includendo particelle lentivirali GFP con 10⁸ unità di trasduzione per mL (TU/mL). Quindi, conservare le dodici microprovette da 1,5 mL (di cui 250 μL per provetta) in condizioni sterili a -80 °C per un massimo di un anno. Preparare molte piccole aliquote della soluzione originale per evitare più cicli di congelamento-scongelamento.

3. Marcatura di cellule organoidi CRC con particelle lentivirali GFP coltivate su matrice extracellulare artificiale

Le procedure sperimentali per l'etichettatura delle cellule organoidi CRC con lentivirus GFP sono descritte nella Figura 1C (passaggio 6).

1. Lasciare crescere gli organoidi CRC preparati nella fase 1.6 senza interferenze per 7-10 giorni, raccoglierli meccanicamente utilizzando un raschietto cellulare sterile e trasferirli in una microprovetta da 1,5 mL.
   nota: La crescita degli organoidi di CRC in coltura dipende dalla natura dei tumori originali dei pazienti. Evitare la crescita eccessiva degli organoidi CRC mantenendoli al 60-70% di confluenza prima del trasferimento con un rapporto di divisione 1:2 su una nuova piastra a 12 pozzetti rivestita di matrice extracellulare artificiale.
2. Centrifugare la microprovetta per 3 minuti a 1.400 x g, rimuovere il terreno di coltura e sciogliere il pellet cellulare in 500 μl di PBS picchiettando delicatamente.
3. Centrifugare la microprovetta per 3 minuti a 1.400 x g ed eliminare la PBS.
4. Per dissociare gli organoidi CRC aderenti, aggiungere 500 μl di una soluzione di distacco cellulare di enzimi proteolitici e collagenolitici al pellet cellulare nella provetta e mescolarlo picchiettando delicatamente. Quindi, lasciare riposare i tubi per 10 minuti a temperatura ambiente.
5. Pipettare molto delicatamente la sospensione cellulare con altri 500 μL di FCS-DMEM all'1% più volte in una microprovetta da 1,5 mL per dissociare approssimativamente le cellule. La generazione di singole cellule dagli organoidi CRC mediante pipettaggio aggressivo riduce notevolmente la vitalità cellulare. Pertanto, è essenziale lasciare la massa di cellule visivamente rilevabile nella sospensione cellulare pipettandola delicatamente in una microprovetta da 1,5 mL.
6. Centrifugare la sospensione cellulare per 3 minuti a 1.400 x g e rimuovere il surnatante.
7. Risolvere il pellet cellulare con una miscela di 100 μL di 5x GFP lentivirus stock (>10⁸ TU/mL) e 400 μL di terreno di coltura di organoidi CRC in una microprovetta da 1,5 mL picchiettando delicatamente per regolare a una concentrazione di 5 x 10⁵ cellule tumorali dissociate per 500 μL. Utilizzare un emocitometro per contare il numero di cellule tumorali, comprese singole cellule e gruppi di cellule nella sospensione cellulare, come descritto sopra (passaggio 1.3).
8. Preparare una piastra a 12 pozzetti rivestita di matrice extracellulare artificiale, come descritto al punto 1.2. Quindi, porre sulla piastra 500 μl della sospensione cellulare preparata al punto 3.7 e lasciarla per 18 ore a 37 °C sotto il 5% di CO₂.
9. Raccogliere il terreno con le cellule galleggianti staccate dalla piastra rivestita di matrice extracellulare artificiale in una provetta da centrifugazione da 1,5 mL. Centrifugarlo a 1.400 x g e quindi rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 70 μL di matrice extracellulare artificiale su ghiaccio.
10. Per aumentare la vitalità delle cellule CRC, sovrapporre la matrice extracellulare artificiale contenente la cellula tumorale agli organoidi tumorali attaccati alla piastra a 12 pozzetti rivestita di matrice extracellulare artificiale, come descritto al punto 1.5. Successivamente, incubare la piastra per 30 minuti in un incubatore a 37 °C, CO₂ al 5% per solidificare il rivestimento della matrice extracellulare artificiale e quindi coltivarla con 1 mL di terreno di coltura per organoidi CRC con FCS all'1% a 37 °C sotto il 5% di CO₂.
11. Osservare le cellule tre giorni dopo l'infezione al microscopio a fluorescenza per confermare quasi il 100% di positività alla GFP grazie all'uso di un alto titolo di particelle lentivirali (vedi Figura 2A).
12. Coltivare gli organoidi CRC per 7-10 giorni per espandere la crescita cellulare prima dell'iniezione nei topi riceventi.

Risultati

Figura 1: Rappresentazione schematica della generazione di metastasi da parte degli organoidi CRC derivati da PDX marcati con lentivirus GFP nei topi NOG.(A) Impianto di piccoli pezzi di tessuto CRC per via sottocutanea in topi NOG (fase 1). Il tessuto CRC sezionato chirurgicamente dal paziente è stato tagliato in pezzi e impiantato per via sottocutanea in topi NOG. s.c.:...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
piastra a 12 pozzetti	BMBio	#92412
per microprovette	Eppendorf	#0030120086	Autoclave prima dell'uso
Emocitometro	Erma	#03-202-1
Matrice della membrana basale Matrigel	Corning	#354234	Conservare le aliquote a -20°C. Mettere in ghiaccio fino al momento dell'uso
Collagenasi tipo 1	sigma	#C1030	150 mg/ml di collagenasi di tipo1 in 1×PBS. Conservare le aliquote a -20°C per un massimo di 1 anno
DMEM/F-12 con GlutaMAX™	Gibco	#10565018
penicillina	Gibco	#15140122	Conservare a 4°C. Utilizzare entro 1 mese
hEGF	PEPROTECH	#AF-100-15	Conservare a -20°C. Aggiungere al fluido il giorno stesso dell'uso
Y27632, un inibitore di ROCK	Wako	#253-00591	Conservare a -20°C. Aggiungere al fluido il giorno stesso dell'uso
streptomicina	Gibco	#15140122	Conservare a 4°C. Utilizzare entro 1 mese
Terreno di coltura di organoidi CRC con FCS all'1% o al 5%			DMEM/F-12 con integratore GlutaMAX™ (Gibco #10565018) integrato con FCS all'1% o al 5%, 100 U/ml di penicillina, 100 μg/ml di streptomicina, 2 ng/ml di hEGF e 10 μM Y27632, un inibitore di ROCK. Conservare a 4°C. Utilizzare entro 1 mese.
Vettore PRRL-GFP	Dono del Dr. Robert A. Weinberg
il reggente di trasfezione FuGENE 6	Roche	11814 443001
pCMV-VSV-G	Dono del Dr. Robert A. Weinberg
pCMV-dR8.2 dvpr	Dono del Dr. Robert A. Weinberg
un microscopio a stereofluorescenza Zeiss Axioplan 2	Zeiss