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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Dissezione di CRC PDX da topi
Le procedure sperimentali per la dissezione dei PDX CRC sono descritte nella Figura 1B (fase 2).
- Lasciare che il tumore cresca per via sottocutanea fino a ~1 cm3 di dimensione, che di solito richiede circa 1-3 mesi.
- Anestetizzare il topo con inalazione di isoflurano utilizzando il dispositivo per anestesia per inalazione di piccoli animali e disinfettare la pelle con etanolo al 70%.
- Posizionare il mouse in posizione prona sul banco del laboratorio. Incidere la pelle, esporre il tumore e staccare con cura la pelle dal tumore usando le forbici sterili. Dopo aver rimosso il tumore, posizionarlo su una piastra di Petri di 10 cm, rimuovere eventuali regioni gravemente necrotiche dal tumore, quindi risciacquare due volte con 5 ml di PBS.
nota: Le aree necrotiche sono spesso più bianche, più morbide e più friabili rispetto alle aree circostanti.
- Posizionare il tumore sul ghiaccio e dividerlo equamente in almeno 4 parti per diverse applicazioni, tra cui 1) la coltura di organoidi CRC, 2) il trapianto in topi secondari, 3) l'esame istologico e 4) il congelamento e la conservazione dei frammenti tumorali.
- Per la generazione degli organoidi CRC, posizionare il tessuto tumorale solido su una capsula di Petri di 6 cm contenente 1 mL di PBS sterile. Mantenere il fazzoletto sul ghiaccio fino alla lavorazione.
- Per stabilire il modello PDX per il CRC umano, passare i PDX CRC freschi in un topo secondario. Tagliare il tessuto tumorale in piccoli pezzi (5 x 5 x 5 mm,3 di dimensioni) utilizzando lame di rasoio sterili e immergere delicatamente questi frammenti di tessuto in 50 μL di matrice extracellulare artificiale. Quindi, impiantare questi frammenti nelle parti inferiori delle tasche sottocutanee destra e sinistra del topo NOG.
- Posizionare il topo anestetizzato in posizione prona sul banco del laboratorio. Praticare una piccola incisione sulla parte inferiore dei fianchi destro e sinistro del topo ricevente per generare tasche sottocutanee per l'impianto di tessuto utilizzando forbici sterili. Fare attenzione a non perforare la membrana peritoneale. Dovrebbe esserci poco sanguinamento con questa procedura.
- Immergere delicatamente i frammenti tumorali sopra preparati in 50 μL di matrice extracellulare artificiale e quindi impiantarli nelle parti inferiori delle tasche sottocutanee destra e sinistra.
- Sutura l'incisione con clip per ferite nei topi sottoposti a procedure chirurgiche. Assicurarsi che i tessuti tumorali impiantati si trovino a una certa distanza dall'incisione sotto la pelle.
nota: In conformità con la minimizzazione delle procedure chirurgiche, in questo studio non sono stati somministrati trattamenti per il dolore e l'infezione post-chirurgica.
- Posizionare il mouse su un pad caldo e mantenere la posizione sdraiata sternale fino a quando non viene ripristinata una sufficiente coscienza. Una volta completamente recuperati e in grado di sedersi su tutte e quattro le zampe, i topi possono essere riportati nelle loro gabbie di casa. Per prevenire la predazione, non consentire l'allevamento con animali non operati nella stessa gabbia.
- Per l'analisi istologica, fissare i campioni in 5 mL di formalina tamponata neutra al 10% in una provetta conica da 15 mL a temperatura ambiente per 2 giorni.
- Per la crioconservazione, tagliare il tessuto tumorale in piccoli pezzi (5 x 5 x 5 mm didimensioni 3) e immergere delicatamente i campioni in 500 μL di soluzione di congelamento cellulare in provette crioviali da 1-1,5 mL. Quindi, trasferire il tubo in un congelatore a -80 °C.
2. Estrazione di PDX nella sospensione cellulare per la coltura di organoidi CRC
Le procedure sperimentali per la dissociazione dei PDX CRC sono descritte nella Figura 1B (passaggio 3).
- Posizionare i frammenti tumorali preparati sopra (passaggio 1.4.1) su una piastra di Petri di 10 cm.
- Tritare i frammenti utilizzando lamette da barba sterili e trasferirli in una provetta conica da 15 ml contenente 8 ml di siero fetale di vitello al 10% (FCS)-Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) con 80 μL di stock di enzima collagenasi (vedi Tabella dei materiali).
- Chiudere bene il tubo e avvolgere il tappo con parafilm per evitare perdite. Per dissociare i frammenti tumorali tritati nella sospensione cellulare, agitarla delicatamente per 2 ore a 37 °C. Si noti che nella provetta rimarranno ancora molti frammenti di tessuto non digerito.
- Centrifugare la provetta a 300 x g per 5 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante. Risolvere il pellet cellulare utilizzando 10 mL di FCS-DMEM al 10% per ottenere la sospensione cellulare.
- Per eliminare i detriti di tessuto non digeriti, filtrare due volte la sospensione cellulare utilizzando il filtro cellulare da 40 μm montato su una provetta conica da 50 mL. Quindi, centrifugare il flusso a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e mantenere il pellet in ghiaccio.
3. Generazione degli organoidi CRC coltivati su matrice extracellulare artificiale
Le procedure sperimentali per la coltura di organoidi CRC dei PDX del colon sono descritte nella Figura 1B (passaggio 4).
- Stabilire un terreno di coltura adatto per gli organoidi CRC derivati da PDX (vedere la Tabella dei materiali, "il terreno di coltura per organoidi CRC") utilizzando terreni precedentemente descritti per gli organoidi del colon umano.
- Applicare 150 μL di matrice extracellulare artificiale (vedi Tabella dei materiali) per pozzetto su una piastra a 12 pozzetti su ghiaccio e poi incubarla per 30-60 minuti in un incubatore a 37 °C, CO2 al 5% per solidificare i gel.
- Sospendere il pellet cellulare dalla fase 2.5 con il terreno di coltura di organoidi CRC (dalla fase 3.1) con FCS al 5% per ottenere l'aggiustamento a 3 x 105 cellule/mL. Quindi, seminare 1 mL di terreno sulla piastra artificiale rivestita di matrice extracellulare preparata al punto 3.2. e incubare per una notte a 37 °C sotto il 5% di CO2. Utilizzare un emocitometro per contare il numero di cellule tumorali, comprese le singole cellule e i cluster multicellulari (un gruppo di cellule aderenti) nella sospensione cellulare.
NOTA: In questo studio viene utilizzato FCS al 5% per estinguere l'attività enzimatica residua della collagenasi.
- Raccogliere con cura il terreno di coltura, comprese le cellule galleggianti staccate dalla piastra rivestita di matrice extracellulare artificiale, in una provetta da centrifuga da 1,5 ml il giorno successivo e centrifugarla a 1.400 x g per 5 minuti. Quindi, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 70 μl di matrice extracellulare artificiale su ghiaccio.
- Per aumentare la vitalità delle cellule CRC, sovrapporre la matrice extracellulare artificiale contenente cellule tumorali sulle cellule organoidi tumorali attaccate alla piastra rivestita di matrice extracellulare artificiale e incubare per 30 minuti in un incubatore a 37 °C, CO2 al 5% per solidificare il rivestimento della matrice extracellulare artificiale. Quindi, incubarlo con 1 mL di terreno di coltura cellulare organoide CRC con FCS all'1% a 37 °C sotto il 5% di CO2.
- Cambiare il terreno di coltura ogni due giorni. Poiché gli organoidi CRC riempiono il terreno, potrebbe essere necessario cambiare il terreno ogni giorno.
4. Generazione e arricchimento di particelle lentivirali GFP
Le procedure sperimentali per la generazione e l'arricchimento di particelle lentivirali GFP sono descritte nella Figura 1C (fase 5).
- Coltivare HEK293T le cellule con il terreno 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) contenente il 10% di FCS e preparare sei piastre da 10 cm (2 x 106 cellule per piastra) per la successiva procedura di trasfezione.
- Per la trasfezione per piastra, preparare 500 μl della miscela, inclusi 20 μl del reagente di trasfezione in DMEM con un vettore PRRL-GFP (5 μg)12 e due plasmidi lentivirali di confezionamento, come pCMV-VSV-G (1 μg) e pCMV-dR8.2 dvpr (5 μg), in una microprovetta sterile da 1,5 mL. Mantenere il composto a temperatura ambiente per 20 minuti, quindi sovrapporlo su ciascuno dei piatti da 10 cm e incubarli per 18 ore.
- Togliere il terreno, aggiungere 5 ml di terreno fresco al 10% FCS-RPMI 1640 in ogni piatto e lasciare riposare per 24 ore.
- Raccogliere il terreno condizionato da ciascuna piastra in una provetta da centrifuga da 50 ml e conservare un totale di 30 ml di terreno a 4 °C per una notte. Aggiungere 5 ml di RPMI 1640 fresco su ogni piatto e lasciare riposare per 24 ore.
- Raccogliere il terreno condizionato da ciascuna piastra in una provetta da centrifuga da 50 ml e conservare, in totale, 30 ml di terreno sul ghiaccio. Quindi, scartare le celle.
- Filtrare 60 mL del terreno (dai passaggi 4.4-4.5) attraverso un filtro da 0.45 μm per rimuovere le cellule e dividere questa quantità in dodici provette da centrifuga in polipropilene da 5 mL per l'ultracentrifugazione.
- Per concentrare i virus, centrifugarli utilizzando un rotore a secchiello oscillante (vedi Tabella dei materiali) a 85.327 x g per 1,5 ore a 4 °C.
- Rimuovere immediatamente il mezzo. Per risolvere il pellet virale concentrato, posizionare 250 μl di Nutrient Ham's Mixture F-12 (F12)/DMEM medium senza FCS in ciascuna delle dodici provette e mantenerlo a 4 °C per una notte. Si noti che il pellet virale è spesso invisibile.
- Pipettare delicatamente il terreno per raccogliere 3 mL del 19 °C concentrato 5x GFP lentivirus, in totale, presumibilmente includendo particelle lentivirali GFP con 108 unità di trasduzione per mL (TU/mL). Quindi, conservare le dodici microprovette da 1,5 mL (di cui 250 μL per provetta) in condizioni sterili a -80 °C per un massimo di un anno. Preparare molte piccole aliquote della soluzione originale per evitare più cicli di congelamento-scongelamento.
5. Marcatura di cellule organoidi CRC con particelle lentivirali GFP coltivate su matrice extracellulare artificiale
Le procedure sperimentali per l'etichettatura delle cellule organoidi CRC con lentivirus GFP sono descritte nella Figura 1C (passaggio 6).
- Lasciare crescere gli organoidi CRC preparati nella fase 3.6 senza interferenze per 7-10 giorni, raccoglierli meccanicamente utilizzando un raschietto cellulare sterile e quindi trasferirli in una microprovetta da 1,5 mL.
nota: La crescita degli organoidi di CRC in coltura dipende dalla natura dei tumori originali dei pazienti. Evitare la crescita eccessiva degli organoidi CRC mantenendoli al 60-70% di confluenza prima del trasferimento con un rapporto di divisione 1:2 su una nuova piastra a 12 pozzetti rivestita di matrice extracellulare artificiale.
- Centrifugare la microprovetta per 3 minuti a 1.400 x g, rimuovere il terreno di coltura e sciogliere il pellet cellulare in 500 μl di PBS picchiettando delicatamente.
- Centrifugare la microprovetta per 3 minuti a 1.400 x g ed eliminare la PBS.
- Per dissociare gli organoidi CRC aderenti, aggiungere 500 μl di una soluzione di distacco cellulare di enzimi proteolitici e collagenolitici al pellet cellulare nella provetta e mescolarlo picchiettando delicatamente. Quindi, lasciare riposare i tubi per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Pipettare molto delicatamente la sospensione cellulare con altri 500 μL di FCS-DMEM all'1% più volte in una microprovetta da 1,5 mL per dissociare approssimativamente le cellule. La generazione di singole cellule dagli organoidi CRC mediante pipettaggio aggressivo riduce notevolmente la vitalità cellulare. Pertanto, è essenziale lasciare la massa di cellule visivamente rilevabile nella sospensione cellulare pipettandola delicatamente in una microprovetta da 1,5 mL.
- Centrifugare la sospensione cellulare per 3 minuti a 1.400 x g e rimuovere il surnatante.
- Risolvere il pellet cellulare con una miscela di 100 μl di 5x GFP lentivirus stock (>108 TU/mL) e 400 μl di terreno di coltura di organoidi CRC in una microprovetta da 1,5 mL picchiettando delicatamente per regolare a una concentrazione di 5 x 105 cellule tumorali dissociate per 500 μl. Utilizzare un emocitometro per contare il numero di cellule tumorali, comprese singole cellule e gruppi di cellule nella sospensione cellulare, come descritto sopra (passaggio 3.3).
- Preparare una piastra artificiale a 12 pozzetti rivestita di matrice extracellulare, come descritto al punto 3.2. Quindi, porre sulla piastra 500 μl della sospensione cellulare preparata al punto 5.7 e lasciarla per 18 ore a 37 °C sotto il 5% di CO2.
- Raccogliere il terreno con le cellule galleggianti staccate dalla piastra rivestita di matrice extracellulare artificiale in una provetta da centrifugazione da 1,5 mL. Centrifugarlo a 1.400 x g e quindi rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 70 μl di matrice extracellulare artificiale su ghiaccio.
- Per aumentare la vitalità delle cellule CRC, sovrapporre la matrice extracellulare artificiale contenente la cellula tumorale agli organoidi tumorali attaccati alla piastra a 12 pozzetti rivestita di matrice extracellulare artificiale, come descritto al punto 3.5. Successivamente, incubare la piastra per 30 minuti in un incubatore a 37 °C, CO2 al 5% per solidificare il rivestimento della matrice extracellulare artificiale e quindi coltivarla con 1 mL di terreno di coltura per organoidi CRC con FCS all'1% a 37 °C sotto il 5% di CO2.
- Osservare le cellule 3 giorni dopo l'infezione al microscopio a fluorescenza per confermare quasi il 100% di positività alla GFP grazie all'utilizzo di un alto titolo di particelle lentivirali (vedi Figura 2A).
- Coltivare gli organoidi CRC per 7-10 giorni per espandere la crescita cellulare prima dell'iniezione nei topi riceventi.
6. Generazione di metastasi da parte di organoidi CRC marcati con GFP in topi riceventi
Le procedure sperimentali per la generazione di metastasi utilizzando gli organoidi CRC marcati con GFP sono descritte nella Figura 1C (passaggio 7).
- Per dissociare gli organoidi CRC marcati con GFP nella sospensione cellulare, raccoglierli meccanicamente utilizzando un raschietto cellulare sterile e trasferirli in una microprovetta da 1,5 mL, come descritto sopra (fase 5.1).
- Centrifugare la microprovetta per 3 minuti a 1.400 x g, rimuovere il terreno di coltura e sciogliere il pellet cellulare in 500 μl di PBS picchiettando delicatamente.
- Centrifugare la microprovetta per 3 minuti a 1.400 x g ed eliminare la PBS.
- Sovrapporre 500 μl della soluzione di distacco cellulare sul pellet cellulare nella provetta e mescolarlo picchiettando delicatamente. Quindi, lasciare riposare la miscela per 10 minuti a temperatura ambiente per dissociare enzimaticamente gli organoidi CRC aderenti, come descritto sopra (passaggio 5.4).
- Pipettare molto delicatamente la sospensione cellulare con altri 500 μL di FCS-DMEM all'1% più volte in una microprovetta da 1,5 mL per dissociare approssimativamente le cellule, come descritto sopra (passaggio 5.5). La generazione di singole cellule dagli organoidi CRC mediante pipettaggio aggressivo riduce notevolmente la vitalità cellulare. Pertanto, lasciare la massa di cellule visivamente rilevabile nella sospensione cellulare pipettandola delicatamente in una microprovetta da 1,5 mL.
- Centrifugare la sospensione cellulare per 3 minuti a 1.400 x g e rimuovere il surnatante.
- Per stabilire un modello murino di metastasi spontanee di CRC PDX:
- Preparare una sospensione cellulare comprendente 5 x 105 cellule in 50 μL di PBS con il 50% di matrice extracellulare artificiale per topo. Mantenere la sospensione sul ghiaccio prima dell'uso. Utilizzare un emocitometro per contare le cellule tumorali, come indicato al punto 3.3.
- Anestetizzare un topo con inalazione di isoflurano utilizzando il dispositivo per anestesia per inalazione di piccoli animali e disinfettare la pelle con etanolo al 70%. Assicurare la normale frequenza e profondità di respirazione e l'assenza di un riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi per una corretta anestesia. L'unguento veterinario sugli occhi è un'opzione per prevenire la secchezza oculare durante l'anestesia.
- Posizionare il mouse NOG in posizione supina sul banco del laboratorio. Afferrare la mucosa rettale con una pinzetta sterile ed estrarla delicatamente dall'ano. Quindi, iniettare immediatamente la sospensione cellulare preparata al punto 6.7.1 nella sottomucosa rettale del topo utilizzando una siringa (dimensione dell'ago: 22 G). Di routine, per valutare i risultati vengono utilizzati 4-6 topi per gruppo.
