Stabilire un modello murino sperimentale di metastasi: impianto di cellule organoidi CRC che esprimono GFP nel modello PDX per rilevare le micrometastasi

Abstract

Fonte: Okazawa, Y. et al. Rilevamento ad alta sensibilità di micrometastasi generate da organoidi trasdotti da lentivirus GFP coltivati da un tumore del colon derivato da un paziente. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video descrive il protocollo per la generazione di metastasi da parte degli organoidi CRC derivati da PDX marcati con lentivirus GFP nella milza di un topo immunodeficiente. Le micrometastasi tumorali che colonizzano altri organi possono essere rilevate utilizzando un microscopio a fluorescenza per valutare l'espressione di GFP.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.

1. Generazione di metastasi da parte di organoidi CRC marcati con GFP in topi riceventi

1. Stabilire un modello sperimentale di metastasi di CRC PDX:
   1. Preparare una sospensione di cellule organoidi CRC comprendente 4 x 10⁴ cellule in 50 μL di PBS per topo. Mantenere la sospensione sul ghiaccio prima dell'uso. Utilizzare un emocitometro per contare le cellule tumorali. (Contare il numero di cellule tumorali, comprese le singole cellule e i cluster multicellulari nella sospensione cellulare).
   2. Anestetizzare un topo con inalazione di isoflurano utilizzando il dispositivo per anestesia per inalazione di piccoli animali e disinfettare la pelle con etanolo al 70%. Assicurare la normale frequenza e profondità di respirazione e l'assenza di un riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi per una corretta anestesia. L'unguento veterinario sugli occhi è un'opzione, per prevenire la secchezza oculare durante l'anestesia.
   3. Posizionare il topo NOG anestetizzato in posizione prona sul banco del laboratorio. Fai una piccola incisione sulla parte inferiore del fianco sinistro e poi taglia il peritoneo per esporre accuratamente la milza usando forbici e pinzette sterili. Afferrare il tessuto adiposo attaccato alla milza con una pinzetta sterile, quindi iniettare lentamente 50 μl della sospensione cellulare (preparata come sopra, passaggio 1.1) nella milza. Assicurarsi che la sospensione cellulare venga iniettata in modo appropriato senza perdite verso l'esterno, dalla milza. Di routine, vengono utilizzati 4 topi per gruppo per valutare i risultati.
2. Posizionare tutti i topi su un cuscinetto caldo dopo l'intervento chirurgico e mantenerli in posizione sdraiata sternale fino a quando non viene ripristinata una sufficiente coscienza. Una volta che i topi si sono completamente ripresi e sono in grado di sedersi su tutte e quattro le zampe, riportateli nelle loro gabbie di casa. Per prevenire la predazione, non consentire l'allevamento con animali non operati nella stessa gabbia.
3. Verificare la presenza di perdite di sutura e confermare che i topi siano vivi, nel gruppo trattato chirurgicamente, il giorno successivo. Controlla i topi per segni di malattia e misura le dimensioni del tumore, utilizzando calibri, in tutti i topi una volta alla settimana.
4. Osservare i topi per rilevare metastasi spontanee (per periodi fino a 2,5 mesi) e metastasi sperimentali (1 mese) dopo l'iniezione.
5. Sacrificare i topi tramite anestesia e lussazione cervicale nei giorni indicati. Sezionare i tumori primari e vari tessuti, tra cui fegato e polmoni. Posizionare i tumori e gli organi sezionati in 5 ml di PBS ghiacciato su una piastra di Petri da 10 cm e conservarli in ghiaccio.
6. Per rilevare le cellule organoidi CRC GFP-positive, osservare i tessuti sezionati al microscopio a stereofluorescenza. Acquisizione di immagini con una telecamera CCD e preparazione con un software di elaborazione delle immagini standard

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Topi NOD/Shi-scid IL2Rγ null (NOG)	L'Istituto Centrale per gli Animali da Esperimento, Kanagawa, Giappone	Allevare topi maschi di 6 settimane in condizioni prive di germi e di agenti patogeni specifici
clip avvolte 2×10 mm	Produzione di Natsume, Giappone	#C-21-S	Autoclave prima dell'uso
Misura dell'ago della siringa di Hamilton: calibro 22	Tokyo Science, Giappone	Disinfettare con alcool al 70% e PBS sterile.
Tubo conico da 50 ml	Sumitomo bachelite	MS-57500
per microprovette	Eppendorf	#0030120086	Autoclave prima dell'uso
Emocitometro	Erma	#03-202-1
Terreno di coltura di organoidi CRC con FCS all'1% o al 5%			DMEM/F-12 con integratore GlutaMAX™ (Gibco #10565018) integrato con FCS all'1% o al 5%, 100 U/ml di penicillina, 100 μg/ml di streptomicina, 2 ng/ml di hEGF e 10 μM di Y27632, un inibitore di ROCK. Conservare a 4°C. Utilizzare entro 1 mese.
un microscopio a stereofluorescenza Zeiss Axioplan 2	Zeiss