Modello di resezione ileale murina: studio del metabolismo biliare indotto dall'ileectomia in un modello murino

Abstract

Fonte: Zhang, R., et al. Sovraaccumulo di bile indotto dall'ileectomia nell'intestino del topo. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video descrive il protocollo dettagliato per la resezione intestinale in un modello murino. Questa tecnica fornisce informazioni sul malassorbimento, il sovraaccumulo e la tossicità biliare indotti dall'ileectomia nell'intestino del topo.

Protocollo

1. Ileectomia e Anastomosi

1. Anestetizzare i topi con isoflurano (2-3%) in una camera di incubazione per piccoli animali. Determinare un'anestesia adeguata utilizzando la tecnica del pizzicamento delle dita dei piedi mentre l'animale è in trattamento con isoflurano.
2. Rimuovere i peli addominali applicando prodotti per la depilazione e rimuovere i peli con spugne chirurgiche mantenendo l'anestesia. Posizionare il topo su un tavolo chirurgico per piccoli animali a temperatura controllata (Figura 1A) per mantenere la temperatura corporea a 37 °C. Mantenere l'anestesia con isoflurano (1 - 2%) attraverso una maschera facciale. Trattare gli occhi del topo con un unguento oculare.
3. Pulire la pelle con iodio povidone e alcol al 70% e coprire l'area chirurgica dell'addome con una garza chirurgica sterile (Figura 1B).
4. Praticare un'incisione addominale sulla linea mediana utilizzando un bisturi chirurgico una volta che l'anestesia è in vigore. Utilizzare un applicatore con punta di cotone per proteggere l'intestino e tirare il muscolo addominale del topo con i divaricatori per aprire ed esporre completamente la cavità addominale (Figura 1C).
5. Individua il cieco. Partendo dal cieco, spostare con cautela l'ileo collegato e parte del digiuno fuori dalla cavità addominale (Figura 1D).
   nota: Il cieco può essere facilmente identificato grazie alle sue grandi dimensioni anche dopo il digiuno.
6. Legare il ramo superiore dell'arteria mesenterica superiore con una sutura di seta 7-0 per occludere il sangue che irrora il segmento ileale da asportare. Il colore ileale cambia dal rosa al viola scuro dopo la legatura. (Figura 1E - F).
7. A seconda dello scopo dell'esperimento, utilizzando le forbici, asportare e rimuovere il 50% o il 90% dell'ileo.
   nota: Per la chirurgia fittizia, non eseguire la legatura dell'arteria mesenterica superiore e non rimuovere l'ileo.
8. Lavare il lume di entrambe le estremità ileali con soluzione fisiologica allo 0,9%.
   nota: Poiché l'ileo intatto rimanente sta ancora ricevendo un normale afflusso di sangue dall'arteria mesenterica superiore, una piccola quantità di sangue verrà espulsa durante il processo. Ciò indica anche che l'afflusso di sangue alle estremità ileali è normale e garantisce l'assenza di ischemia durante la procedura di anastomosi (Figura 1G).
9. Individua i mesenteri sul lato di entrambe le estremità ileali. Allineare i mesenteri e suturare le estremità ileali insieme usando 8-0 sutura (Figura 1G - H).
10. Sutura il lato controlaterale dell'ileo per mantenere l'ileo anastomizzato in modo naturale (Figura 1I).
11. Sutura i lati superiore e inferiore tra le due suture originali per unire completamente le due estremità ileali (Figura 1J).
12. Verificare che non vi siano perdite dal sito dell'anastomosi dopo aver terminato la procedura di sutura in tre fasi (Figura 1G-I). Rimettere il cieco e l'intestino tenue nella cavità addominale nella posizione anatomica originale. Lavare l'area chirurgica con soluzione fisiologica calda allo 0,9% utilizzando un ago smussato. (Figura 1K).
13. Chiudere l'incisione dello strato muscolare addominale con una sutura 6-0. Allineare l'incisione cutanea addominale utilizzando una pinza e suturare la pelle addominale per facilitare la guarigione ottimale della ferita (Figura 1L).

2. Assistenza post-operatoria

1. Trasferire i topi post-operatorio in un'unità di terapia intensiva per il recupero. Ospitali in una gabbia per lettiera di carta su un termoforo a temperatura controllata per continuare il recupero post-operatorio durante la notte. Fornisci ai topi cibo morbido oltre a cibo e acqua regolari.
2. Somministrare buprenorfina (0,05 - 0,1 mg/kg) con iniezione sottocutanea ogni 8-12 ore per analgesia.
   nota: Eutanasia dei topi con CO₂ se gravemente malati.
3. Al punto finale, sacrificare i topi utilizzando isoflurano sovradosato e raccogliere campioni secondo necessità (sezione 3).

3. Valutazione del sovraaccumulo di bile indotto dall'ileectomia

1. Pesare e sezionare i topi un giorno dopo la resezione dello 0% (sham), del 50% o del 90% dell'ileo.
2. Rimuovere il tratto gastrointestinale e pesarlo. Calcolare il rapporto tra peso gastrointestinale e peso corporeo per valutare la gravità del malassorbimento e del sovraaccumulo di sali biliari.
3. Trasferire i tratti gastrointestinali in provette coniche da 15 ml e tagliarle in segmenti corti con le forbici. Dopo il taglio, centrifugare a 3.000 x g per 10 min. Trasferire il surnatante (fluido gastrointestinale contenente sali biliari) in una provetta pulita.
4. Misurare il volume totale e il peso del liquido gastrointestinale e calcolare il rapporto tra il peso del fluido e il peso del tratto gastrointestinale per valutare ulteriormente il sovraaccumulo di bile nel tratto gastrointestinale.
5. Determinare la quantità totale di bile nel surnatante mediante saggio degli acidi biliari.

Risultati

Figura 1: Procedure chirurgiche di ileectomia. (A) Mantenere la temperatura corporea utilizzando un tavolo chirurgico per piccoli animali a temperatura controllata. (B) Coprire l'area chirurgica con garze sterili dopo la preparazione della pelle addominale. (C) Esporre l'intestino tenue attraverso un'incisione addominale sulla linea mediana. (D) Il cieco (evidenziato dalla linea tratteggi...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
C57BL/6J	Il laboratorio Jackson
Microscopio di dissezione	Olimpo	SZ61	Per chirurgia
Regolatore di temperatura per animali	Strumenti Physitemp, Inc	TCAT-2LV	Per il controllo della temperatura corporea
Vaporizzatore anestetico isoflurano	VetEquip	911104	Per anestesia
Pinza per dissezione	Strumenti di scienza fine, Inc.	Codice 11274-20	Per chirurgia
forbici	Strumenti di scienza fine, Inc	Codice 14084-08	Per chirurgia
Porta aghi	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-7882	Per chirurgia
Micro coltelli-lama dell'ago	Fisher Scientifico	Codice 10318-14	Per chirurgia
Sutura monofilamento 6-0	Ethicon	1698G	Per la chiusura della pelle addominale
Sutura di seta 7-0	Ethicon	766G	Per la legatura
Sutura monofilamento 8-0	Ethicon	1714G	Per l'anastomosi
Spugne chirurgiche	Dynarex Corp.	Codice: 3333	Per chirurgia
Piccoli applicatori con punta in cotone	Fisher Scientifico	23-400-118	Per chirurgia
Isoflurano	Piramal Healthcare Limited	Codice 66794-013-25	Per anestesia
Buprenorfina cloridrato	Reckitt-Benckiser Prodotti farmaceutici	Codice 12496-0757-1	Per analgesia
Iniezione di cloruro di sodio allo 0,9%	B. Braun Medical Inc.	Codice 0264-7800-10	Per lavaggio/iniezione
Soluzione per la preparazione dello iodio povidone	Dynarex Corp.	Anno 1413	Per la preparazione della pelle
Unguento veterinario Puralube	Prodotti veterinari Dechra	Codice 17033-211-38	Per la protezione degli occhi
Lozione depilante	Chiesa & Dwight Co., Inc.		Per la preparazione della pelle
Unità di terapia intensiva	ThermoCare	FW-1	Per il recupero post-operatorio
Kit per il dosaggio degli acidi biliari totali	Genzyme Diagnostico	DZ042A-K01	Per il dosaggio degli acidi biliari