Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Induzione Tumorale Locale tramite Infezione Chirurgica da Adeno-Cre
- Preparazione degli animali per la chirurgia
nota: Praticamente qualsiasi mutazione condizionale ("floxed") può essere indotta attraverso il metodo qui descritto. Si raccomanda l'uso di mutazioni in geni rilevanti per il cancro del colon-retto, come Apc, Kras o Tp53. L'efficienza della ricombinazione Cre dipende dalla dimensione del costrutto da asportare. Le grandi sequenze floxate vengono asportate in modo meno efficiente. La ricombinazione di tutti gli alleli dovrebbe essere confermata nei tumori mediante PCR.
- Per lo sviluppo dei tumori del colon-retto, utilizzare un incrocio dei seguenti alleli condizionali per un modello di base di CRC (numero di database MGI tra parentesi):
Apctm2Rak (MGI: 3688435)
Krastm4Tyj (MGI: 2429948)
Tp53tm2Tyj (MGI: 3039263)
- Se è necessario un allele reporter di fluorescenza (ad esempio, per rilevare micrometastasi), utilizzare il seguente allele:
Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze (MGI: 3809522)
nota: Tutti i ceppi di cui sopra sono disponibili tramite l'NCI Mouse Repository o il Jackson Laboratory. Non è richiesto il digiuno poiché tutta la materia fecale rimanente può essere espulsa prima dell'infezione adenovirale. Il digiuno preoperatorio porta a una maggiore mortalità perioperatoria e costituisce un enorme stress per i piccoli roditori.
- Utilizzare il sevoflurano a 3 - 3,5 vol% per l'anestesia generale. Una perdita del riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi indica un'anestesia sufficiente.
- Prima della prima incisione, iniettare 0,05 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea.
- Coprire gli occhi del topo anestetizzato con un unguento oftalmico per evitare l'essiccazione della cornea.
- Posiziona il mouse in posizione supina su un tavolino. Utilizzare nastri adesivi non traumatici per trattenere il mouse.
- Radere l'addome con un rasoio elettrico (in alternativa si può usare una crema depilatoria) e disinfettare con tamponi imbevuti di alcol o iodio. Utilizzare il tempo di contatto raccomandato dal produttore.
- Copri il campo chirurgico con teli sterili.
nota: L'uso di antibiotici perioperatori è facoltativo e soggetto alle linee guida istituzionali.
- Utilizzare strumenti sterili monouso o sterilizzati per tutte le procedure chirurgiche.
- Laparotomia della linea mediana ed esposizione del colon
- Utilizzare le forbici (in alternativa si possono usare i bisturi) per praticare un'incisione sulla linea mediana (~ 15 mm) sulla pelle del basso ventre.
- Prelevare la muscolatura della parete addominale con una pinza e inciderla con cura con le forbici, aprendo la cavità addominale.
- Identificare il colon distale, toccarlo solo con una pinza atraumatica. Clamp il colon con un morsetto delicato (ad es. un morsetto vascolare Micro Serrefine) a circa 15 mm prossimalmente dall'ano.
nota: Prestare particolare attenzione alla vulnerabilità del colon in ogni momento. La perforazione porta inevitabilmente a peritonite e sepsi e richiede l'eutanasia dell'animale.
- Infezione segmentale del colon con il virus Adeno-cre
- Inserire un tubo flessibile in teflon per via transanale e farlo avanzare con cautela fino a raggiungere l'occlusione del lume raggiunta dalla pinza precedentemente posta a 15 mm dal bordo anale. Non esercitare una forza eccessiva in quanto ciò potrebbe causare la perforazione.
- Cannulare il tubo con una cannula da 30 G, collegare una siringa standard da 1 ml e lavare il colon con soluzione fisiologica normale per evacuare la materia fecale rimanente. Ciò può richiedere diversi ml di soluzione fisiologica.
- Una volta che il colon distale è vuoto, rimuovere il tubo e sostituirlo con un nuovo tubo in teflon e posizionarlo nuovamente direttamente distalmente al morsetto come descritto sopra.
- Occludere il colon con un secondo morsetto ~ 3 mm distalmente al morsetto prossimale (cioè, sopra il tubo inserito, ~ 12 mm dal bordo anale), risultando in un segmento isolato di 3 mm da infettare.
nota: Per l'occlusione distale del segmento, le clip coronarie di Fogarty si sono dimostrate le più adatte in quanto sono gommate, portando a un'occlusione stretta del colon nonostante il tubo intraluminale tra i rami del morsetto.
- Utilizzare una seconda siringa (standard da 1 ml con una cannula da 30 G) per iniettare con cura 50 - 80 μL di tripsina-EDTA allo 0,25% nel segmento del colon bloccato e incubare per 10 minuti. Lasciare la cannula e la siringa attaccate al tubo di teflon per evitare che il fluido >nota: Il colon deve essere gonfiato per rompere la barriera mucosa e raggiungere le cellule staminali della cripta, ma non troppo gonfio per evitare la perforazione del segmento bloccato.
- Per prima cosa, rimuovere il morsetto distale e poi il tubo della tripsina.
- Sciacquare il colon distale con ~ 500 μL di soluzione fisiologica normale per rimuovere la tripsina rimanente.
- Inserire una nuova provetta in teflon, riposizionare il morsetto distale e gonfiare il segmento del colon con 50 - 80 μL di soluzione adenovirale (1011 unità formanti placche (PFU)/mL in soluzione salina tamponata con fosfato) e incubare per 30 minuti (Figura 2A).
nota: Non versare la soluzione virale poiché il contatto con adeno-cre può portare allo sviluppo di tumori in qualsiasi tessuto di topi condizionatamente mutanti.
- Rimuovere le fascette e il tubo.
- Chiusura dell'addome e recupero postoperatorio
- Chiudere la parete addominale con suture da corsa 6-0 rapidamente assorbibili (ad es. polidiossanone (PDS)).
- Chiudere la pelle con clip per ferite chirurgiche.
- Posizionare il mouse su un termoforo impostato a 38 °C fino a quando non si riprende completamente dall'anestesia.
- Somministrare un altro bolo di 0,05 mg/kg di buprenorfina i.p. 12 ore dopo l'intervento chirurgico, seguito da ulteriori boli di buprenorfina ogni 12 ore, se necessario.
- Monitorare i topi almeno una volta al giorno per segni di angoscia dovuti alla crescita del tumore.
2. Colonscopia
NOTA: A seconda delle mutazioni condizionali utilizzate, l'infezione adenovirale porta a tumori visibili endoscopicamente entro 2 - 4 settimane. Pertanto, eseguire la prima colonscopia postoperatoria 2 settimane dopo l'induzione adenovirale e ripetere ogni 2 settimane. Per la colonscopia murina si consiglia un sistema disponibile in commercio.
- Preparazione degli animali per la colonscopia
nota: Non è richiesto il digiuno. La materia fecale rimanente è solitamente ben formata nel colon distale e può essere spinta oltre il tumore durante la colonscopia, rendendo superfluo il processo stressante del digiuno ripetuto.
- Utilizzare il sevoflurano a 3 - 3,5 vol% per l'anestesia generale. Una perdita del riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi indica un'anestesia sufficiente.
- Coprire gli occhi dei topi anestetizzati con un unguento oftalmico per evitare l'essiccazione della cornea.
- Trattieni i topi in posizione supina su un tavolino.
- colonscopia
- Inserire l'endoscopio (diametro 1,9 mm; lunghezza 10 cm) nel tratto intestinale attraverso l'ano e insufflare accuratamente l'aria sotto controllo visivo per distendere il colon. Non insufflare più aria di quella necessaria per l'esame.
nota: Per l'insufflazione d'aria, può essere utilizzata la pompa dell'aria antiappannamento del sistema di colonscopia. Se non è disponibile una pompa dell'aria antiappannamento, è possibile utilizzare qualsiasi altra pompa dell'aria con impostazioni di pressione molto basse o aria pressurizzata con una delicata valvola di riduzione della pressione. L'anidride carbonica (CO2) porta facilmente all'acidosi nei piccoli roditori e deve quindi essere evitata.
- Spingere con cautela l'endoscopio in avanti fino a quando non è possibile identificare una lesione della mucosa nel colon distale (Figura 1A - 1D).
- Salvare le immagini endoscopiche per una valutazione successiva. In precedenza è stato descritto un sistema di punteggio endoscopico per i tumori intraluminali.
- Rimuovere con cautela l'endoscopio e posizionare il mouse su un termoforo impostato a 38 °C fino a quando non si è completamente ripreso dall'anestesia.
