1. Saggio di legame dei microtubuli
- Per il test di legame dei microtubuli, aggiungere ~1 x 106 cellule HCT 116 in piastre di coltura tissutale da 100 mm contenenti il Minimum Essential Media (MEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina. Dopo un giorno di coltivazione, le cellule raggiungeranno il 60-70% di confluenza.
- Preparare un tampone PEM 1X (2 mL) da un tampone PEM 10X conservato a 4 °C aggiungendo 20 μM (40 μL) di paclitaxel e 1 mM (20 μL) di GTP. Prelevare il materiale di produzione di microtubuli (MT) dal congelatore a -80 °C e il materiale di lavoro di E. coli tau dal congelatore a -20 °C.
- Preparare i campioni come da Tabella 1.
- Incubare a 37 °C per 30 min. Ultracentrifugare a 25 °C per 60 min a 100.000 x g.
- Trasferire 120 μl di surnatanti contenenti tau non legata, in provette pulite ed etichettate.
- Aggiungere 120 μl (stesso volume del surnatante) di tampone campione 5X al pellet contenente tau legata e mescolare accuratamente. Trasferire la soluzione in provette pulite etichettate e mescolare accuratamente.
- Misurare la concentrazione di proteine con il test Bradford utilizzando kit di analisi proteiche commerciali.
nota: Durante la preparazione dei campioni, utilizzare il volume di soluzione (passaggio 1.6) per preparare sia il pellet che il surnatante.
- Prepara campioni di concentrazione proteica equivalente e aggiungi 4x tampone di caricamento gel SDS appena preparato contenente DTT (400 mM).
nota: In questa fase i campioni possono essere conservati a -20 °C.
- Incubare i campioni su un blocco termico a 100 °C per 5 minuti. Mescolare i campioni utilizzando un vortice. Raffreddare a temperatura ambiente per ~10-15 min.
- Assemblare un sistema di elettroforesi per l'esecuzione di un gel di poliacrilammide al 10% di SDS-PAGE.
- Caricare 10 μg di proteine (13 μL di campione) per pozzetto su un gel di poliacrilammide al 10%. Caricare la scala a graduatoria.
- Dopo aver caricato il campione, collegare gli elettrodi positivo e negativo del sistema di elettroforesi a una fonte di alimentazione per mantenere una tensione costante. Inizialmente, iniziare a 70 V per 20 minuti per spostare i campioni di proteine dal gel di impilamento al gel risolutivo. Quindi, aumentare la tensione a 125 V e far funzionare il gel per circa 70-120 minuti fino a quando i campioni e la scala proteica raggiungono la fine del gel.
- Dopo il completamento dell'elettroforesi, trasferire il gel su una membrana in PVDF utilizzando un sistema di elettroblotting a umido. Trasferimento per ~100 min a 100 V.
- Segna la macchia praticando un piccolo taglio sul lato della scala del peso molecolare. Utilizzare un foglio di plastica trasparente e un taglierino affilato per tagliare la macchia.
- Bloccare la membrana in tampone bloccante BSA al 4% per 90 minuti a temperatura ambiente.
- Incubare il blot in soluzione di anticorpi primari (anti-tau a 1:5.000) a 4 °C per una notte. Lavare la macchia in PBST quattro volte, per 7 minuti ciascuna.
- Preparare la soluzione di anticorpi secondari pertinente (IgG di capra anti-topo a 1:5.000) e incubare il blot per 90 minuti a temperatura ambiente. Lavare in PBST quattro volte, per 7 minuti ciascuna.
- Sviluppare il blot utilizzando un kit di chemiluminescenza secondo le raccomandazioni del produttore. Coprite la macchia con pellicola trasparente. Acquisizione di immagini mediante un sistema di imaging a chemiluminescenza per la chemiluminescenza con il software pertinente.
Tabella 1: Preparazione del campione per il saggio di legame dei microtubuli.
| campione | nome | Microtubuli necessari | Principali proteine necessarie | PEM-GTP-PTX |
| 1 | Controllo HCT 116 (6,21 μg/μl) | 2 μl | 60 μg (9,66 μl) | 108,34 μl |
| numero arabo | HCT 116-Curcumina 10 μM (4,81 μg/μl) | 2 μl | 80 μg (16,63 μl) | 101,37 μl |
| 3 | HCT 116-Curcumina 20 μM (3,28 μg/μl) | 2 μl | 100 μg (30,49 μl) | 87,51 μl |
| 4 | HCT 116-LiCl 25 mM (5,43 μg/μl) | 2 μl | 100 μg (18,42 μl) | 99,58 μl |
| 5 | E. coli tau | 2 μl | 1 μl di tau-352 | 117 μl |
| 6 | Solo MT | 2 μl | X | 118 μl |
| | | | 120 μl ciascuno |
