Isolamento CTC da un campione di sangue intero: un metodo per ottenere CTC da un modello di cancro colorettale murino

Abstract

Fonte: Kochall, S., et al. Isolamento di cellule tumorali circolanti in un modello murino ortotopico di cancro del colon-retto. J. Vis. Exp. (2017).

Questo video descrive un protocollo dettagliato per isolare le cellule tumorali circolanti dal campione di sangue intero di un modello murino di tumore colorettale soppresso. Queste CTC isolate possono essere coltivate e utilizzate per l'analisi a valle prevista.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria di JoVE.

1. Isolamento delle cellule tumorali circolanti da campioni di sangue intero

NOTA: Ottenere sangue mediante puntura cardiaca transcutanea su topi anestetizzati, seguita da eutanasia. Idealmente, 1.000 μL di sangue vengono aspirati in una siringa preriempita con 100 μL di un anticoagulante (acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) o eparina). Utilizzare un anticorpo anti-EpCAM (molecola di adesione delle cellule epiteliali) per identificare le CTC. Questo funziona molto bene se nel modello murino vengono utilizzate linee cellulari epiteliali umane. Per altre applicazioni, possono essere necessari anticorpi diversi.

1. Arricchimento CTC:
   1. Preriempire le provette da 15 mL con un terreno a gradiente di densità da 5 mL e trasferire con cura il sangue nella provetta da 15 mL.
   2. Centrifugare (30 min a 300 x g senza freno) e rimuovere con cautela il surnatante superiore.
   3. Versare il resto in una nuova provetta da 15 ml e centrifugare (15 min, 300 x g con freno).
   4. Recuperare l'interfase contenente le cellule mononucleate (scartare il resto) e lavare le cellule due volte con PBS.
   5. Risospendere il pellet in 200 μL di PBS/1% EDTA e aggiungere 4 μL di anticorpo EpCAM. Incubare 20 minuti con ghiaccio al buio.
2. Vagliatura e picking
   1. Preparare il seguente tampone (di seguito denominato tampone di prelievo): PBS + 10% siero fetale di vitello (FCS) + 1% Penicillina/Streptomicina (1%) + 0,8% EDTA.
   2. Utilizzare una penna PAP per disegnare un cerchio di ~1 cm in una piastra di Petri sterile da 6 cm (impedisce al fluido di disperdersi nella piastra) e pipettare 700 μl di tampone di prelievo in questo cerchio.
   3. Aggiungere 50 μl di sospensione cellulare al tampone di prelievo da 700 μl all'interno del cerchio. Controllare la densità delle cellule con il microscopio. Dividi il campione in diversi piatti se è troppo denso.
   4. Attendere che le celle si stabilizzino (~5 min).
   5. Esaminare la goccia di sospensione cellulare per verificare la presenza di cellule colorate (= EpCAM-positive).
   6. Una volta trovata una cellula, prelevare la cellula con il micromanipolatore e metterla in un tampone da 50 μl a seconda dell'analisi a valle prevista (ad esempio, tampone di estrazione dell'RNA o terreno di coltura).
   7. A seconda delle analisi a valle previste, isolare le cellule e/o il terreno EpCAM-negativi come controlli negativi.
   8. Procedere con le analisi a valle (ad es. coltura cellulare, PCR).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Gradiente di densità medio – Ficoll	Cellule staminali - Lymphoprep	Codice: 7801
Alexa Fluor 488 anti-umano CD326 (EpCAM) Clone di anticorpo 9C4	BioLeggenda	Codice 324210
Alexa Fluor 488 anti-topo CD326 (EpCAM) Clone di anticorpi G8.8	BioLeggenda	Codice 118210
Piastra di Petri, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Sfiato	Greiner bio-one	628102
Microscopio per colture cellulari a fluorescenza	Leica
Micromanipolatore Transferman 4r	Eppendorf
CellTram Aria	Eppendorf		pompa di aspirazione collegata al micromanipolatore
Estrattore universale per microelettrodi Dmz	Società Dagan		necessari per la produzione di micro capillari per l'aspirazione di singole cellule
Capillari in vetro prismatico	Società Dagan
Penna PAP	Abcam
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco	Life Technologies GmbH	14190169	buffer di prelievo
Siero fetale di vitello (FCS)	BIOCHROM AG	S 0115	buffer di prelievo
Penicillina/Streptomicina (PenStrep)	Life Technologies GmbH	15140122	buffer di prelievo
Edta	Roth	8040.1	buffer di prelievo
Immunoistochimica
Clone 9C4 di anticorpi CD326 (EpCAM) anti-umano purificato	BioLeggenda	324201	Immunoistochimica EpCAM
HRP coniglio anti-topo IgG	Abcam	ab97046	Immunoistochimica EpCAM