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1. Preparazione organotipica:
Preparazione del gel organotipico impregnato di fibroblasti:
- Preparare una sospensione di cellule fibroblastiche contenente 5 x 105 cellule per organotipico in DMEM integrata con il 10% di FCS e 292 μg/ml di L-Glutammina.
- Preparare i gel organotipici con ghiaccio nelle seguenti proporzioni:
- • 7 volumi di Rat-Tail Collagen: Matrigel mix (1:1)
- • 1 volume di DMEM filtrato 10x
- • 1 volume di FCS
- • 1 volume di sospensione cellulare di fibroblasti contenente 5 x 105 fibroblasti
Per 9 gel (1 ml per gel), preparare 10 ml e mescolare delicatamente per evitare bolle.
- Aggiungere 1 ml a ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e incubare per 1 ora a 37 °C in un'atmosfera umidificata per consentire ai gel di solidificarsi. Dopo 1 ora, aggiungere 1 ml di DMEM (10% FCS)/Glut sopra i gel e rimettere nell'incubatore per una notte.
- Il giorno seguente, aspirare il terreno dalla parte superiore dei gel e preparare 1 ml di terreno contenente 5 x 105 cellule epiteliali CRC.
Preparazione dei fogli di nylon gel-rivestiti:
- Prepara in anticipo fogli di nylon sterili e autoclavati di 1,5 cm x 1,5 cm.
- Utilizzando una pinza sterile, posizionare il numero richiesto di fogli di nylon in una piastra di coltura di 10 cm (di solito è possibile alloggiare 4 fogli di nylon per piatto).
- Preparare il gel con ghiaccio nel seguente ordine (sono necessari 250 μl di volume totale per foglio di nylon):
- • 7 volumi di Collagene Coda di Topo
- • 1 volume di DMEM filtrato 10x
- • 1 volume di FCS
- • 1 volume di DMEM 10% FCS/Glut
- Se la soluzione è gialla, neutralizzare aggiungendo 0,1 M di NaOH in aliquote da 50 μl fino a quando la soluzione diventa rosa.
- Aggiungere 250 μl di questa soluzione a ciascun foglio di nylon e incubare a 37 °C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2 per 30 minuti per consentire al gel di solidificarsi.
- Trucco Soluzione di glutaraldeide all'1% in PBS. Aggiungere 10 ml a ciascuna piastra di coltura da 10 cm una volta che il gel si è solidificato e incubare a 4 °C per 1 ora.
- Lavare i fogli di nylon 3 volte in PBS e 1 volta in DMEM (10% FCS)/Glu e incubare per una notte in DMEM/Glu a 4 °C.
Lievitazione di gel organotipici su griglie d'acciaio per l'invasione:
- Pre-prepara le griglie delle impalcature piegando le lamiere di acciaio inossidabile in una formazione a treppiede. Autoclavare in autoclave prima dell'uso.
- Utilizzare una pinza sterilizzata in etanolo per posizionare una griglia d'acciaio in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti.
- Posiziona un foglio di nylon rivestito di gel con il lato di collagene rivolto verso l'alto, su ciascuna griglia.
- Trasferire con cura i gel organotipici dalla piastra a 24 pozzetti al foglio di nylon sollevato utilizzando una spatola sterilizzata in etanolo.
- Riempire il pozzetto con DMEM 10% FCS/Glut integrato con il 10% di FCS fino a quando il foglio di nylon non è a contatto con il mezzo ma non sommerso. Assicurarsi che il terreno non tocchi il gel organotipico.
- Incubare per 14 giorni a 37 °C in atmosfera umidificata al 5% di CO2, sostituendo il terreno ogni 2 giorni.
2. Fissazione organotipica
- Rimuovere l'intero foglio di nylon dal pozzetto e posizionarlo sulla pellicola trasparente.
- Sezionare il foglio organotipico e il foglio di nylon utilizzando un bisturi monouso pulito e fissare entrambe le metà in formaldeide per 24 ore a temperatura ambiente.
- Sostituire la formaldeide con etanolo al 70% dopo 24 ore e lasciare agire per una notte prima di incorporare in paraffina, sezionare e colorare.
3. Microdissezione laser del margine invasivo
- Sezione a 10 μm di spessore su vetrini montati su membrana.
- Deparaffinare le sezioni applicando xilene per 1 minuto, quindi rimuovere lo xilene e fissare l'etanolo al 75% per un ulteriore 1 minuto.
- Rimuovere l'etanolo e colorare con la soluzione di Cresyl Violet allo 0,125% per 1 min. Cresyl Violet evidenzia le cellule epiteliali e consente una facile discriminazione dallo stroma.
- Rimuovere Cresyl Violet e applicare etanolo al 100% per un altro 1 minuto prima di risciacquare con etanolo al 100%. Lasciare asciugare i vetrini all'aria per 30 minuti.
- Eseguire la microdissezione laser utilizzando la piattaforma scelta (ad es. il sistema Leica AS).
- Posizionare il vetrino con la sezione colorata da microsezionare a faccia in giù sul tavolino del microscopio.
- Montare una provetta per microcentrifuga da 0,5 ml nella cassetta di raccolta e aggiungere 50 μl di tampone di lisi cellulare (ad es. tampone di DNA, RNA o lisi proteica) al tappo in cui si raccoglierà il tessuto microdissezionato.
- In visione diretta, utilizzare il joystick per identificare il tessuto di interesse. Utilizzando l'interfaccia del software, annotare la sezione organica colorata, evidenziando le cellule da microdissezionare sul fronte dell'invasione tumorale.
- Istruire il laser a sparare, che dovrebbe sia ritagliare la sezione evidenziata che spingere il tessuto microsezionato nel tappo della provetta della microcentrifuga.
- Una volta raccolta una quantità sufficiente di materiale, espellere la cassetta di raccolta, chiudere la provetta per microcentrifuga e centrifugare delicatamente per aspirare il tampone di lisi sul fondo della provetta.
- Posizionare i campioni sul ghiaccio fino al completamento della microdissezione. Processare i campioni con un metodo appropriato per estrarre l'analita di interesse.