Saggio di citometria da trazione: un metodo per quantificare la forza di trazione esercitata dalle cellule tumorali sulla ECM

Abstract

Fonte: Ali, M. Y., et al. Isolamento di cellule tumorali primarie del colon umano da tessuti chirurgici e loro coltura direttamente su substrati elastici morbidi per citometria da trazione. J. Vis. Exp. (2015).

Questo video descrive il test di microscopia della forza di trazione. Il test determina la trazione cellulare delle cellule tumorali del colon umano sulla matrice extracellulare presente su idrogel elastico morbido con perle fluorescenti incorporate. Lo spostamento risultante delle perle fluorescenti viene misurato utilizzando un software appropriato.

Protocol

1. Saggio di microscopia della forza di trazione

1. Scaldare la soluzione 0,25% tripsina-EDTA/10% SDS a 37 °C in bagnomaria per 10 minuti prima dell'inizio degli esperimenti di trazione.
2. Rimuovere un gel (funzionalizzare i gel PA e il vetro con molecole ECM, fibronectina umana a una concentrazione di 50 μg/ml) dall'incubatore per colture cellulari alla volta e posizionarlo sul tavolino fluorescente del microscopio invertito (ingrandimento 32X).
3. Trova una singola cella nel campo visivo. Rimuovere il coperchio della capsula di Petri.
4. Scattare un'immagine a contrasto di fase della cella (ad esempio, Figura 1).
5. Passare dalla modalità di imaging alla fluorescenza e selezionare il filtro appropriato. Non spostare il tavolino del microscopio o il campione durante questo periodo.
6. Scattare un'immagine delle perle fluorescenti spostate dalla trazione cellulare (Figura 2C).
7. Aggiungere 1 ml di soluzione di tripsina/SDS alla capsula di Petri per staccare la cellula dal gel. Non spostare il tavolino del microscopio o il campione durante questo periodo. Inoltre, scattare un'immagine di controllo della cellula per garantire la completa rimozione dal gel.
8. Scatta un'immagine di riferimento (forza nulla) delle perline dopo che la cella è stata rimossa.
9. Ripetere i passaggi 1.2-1.8 per tutti gli altri gel.
10. Creare una pila di immagini utilizzando ImageJ dalle due immagini acquisite nei passaggi 1.6 e 1.8 per ciascun caso. Per generare la pila di immagini, utilizzare la seguente sequenza di comandi in ImageJ dopo aver aperto le immagini: Image → Pile → Immagini da impilare.
11. Per ottenere il campo di spostamento e la trazione, utilizzare i plug-in ImageJ seguendo i metodi pubblicati. Ottieni codici e tutorial dettagliati per questi plugin utilizzando il seguente link: https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins.
    1. Allinea le immagini nella pila utilizzando il plug-in "Corrispondenza modello". Utilizzare la seguente sequenza di comandi in ImageJ dopo aver aperto la pila di immagini generata nel passaggio 1.10: Plug-in → Corrispondenza modello → Allinea sezioni in pila → OK. Salvare la pila di immagini di conseguenza. Utilizza questo nuovo stack di immagini nei passaggi seguenti.
    2. Ottieni il campo di spostamento utilizzando il plug-in PIV (particle image velocimetry) (Figura 2D). Utilizzare la seguente sequenza di comandi dopo aver aperto la pila di immagini salvata nel passaggio 1.11.1: Plug-in → PIV → PIV iterativo (base) → OK → Accetta questo PIV e l'output → OK. Salva l'output PIV nella stessa directory della pila di immagini originale. Usalo come input nel passaggio successivo.
    3. Infine, utilizzare il plug-in FTTC (citometria di trazione in trasformata di Fourier) per ottenere la mappa di trazione (Figura 2E). Utilizzare la seguente sequenza di comandi: Plug-in → FTTC → Inserisci le proprietà del materiale, ad esempio il modulo di Young e il rapporto di Poisson del gel PA → OK → Selezionare il file di output PIV salvato nel passaggio 1.11.2 → OK. Salva i risultati FTTC nella stessa directory della pila di immagini e dell'output PIV.

Results

Figura 1. Coltura primaria di cellule di colon umano di successo (sia cancerogena che normale) su diversi gel rigidi e su piastra di polistirene. Le immagini a contrasto di fase mostrano la morfologia tipica di (A) cellule tumorali e (B) cellule normali su diversi substrati di rigidità.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pbs	Lonza	17-516F
tripsina	Worthington	LS003736
acrilamide	Sigma-Aldrich	Codice: A4058
N-metilenbisacrilammide (bis)	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale M1533
Fibronectina umana	BD bioscienze	354008
Perle fluorescenti da 0,1 μm	Tecnologie di vita	F8801
0,25% tripsina-EDTA	Tecnologie di vita	Codice 25200-056
vetrini in vetro da 12 mm2	Corning	Codice 2865-12