Saggio di organizzazione del citoscheletro e dell'adesione focale: un metodo basato sull'immunofluorescenza per studiare l'adesione cellulare e la diffusione su substrati

Abstract

Fonte: Ali, M. Y et al., Isolamento di cellule tumorali primarie del colon umano da tessuti chirurgici e loro coltura diretta su substrati elastici morbidi per citometria da trazione. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video descrive la tecnica di studio del citoscheletro e delle aderenze focali nelle cellule primarie di cancro del colon umano per comprenderne le variazioni a seconda della rigidità del substrato. Questa coltura di cellule tumorali su substrati morbidi e duri consente varie misurazioni biofisiche a valle per la prognosi del cancro.

Protocollo

1. Saggi di microscopia a immunofluorescenza

1. Portare i substrati con le cellule da immunocolorare sulla cappa laminare e rimuovere il terreno di coltura.
2. Sciacquare i substrati con PBS e fissare le cellule con paraformaldeide al 4% in PBS per 20 minuti a RT.
3. Lavare i substrati con PBS tre volte (5 minuti ogni volta). Di conseguenza, incubare i substrati con 500 μl di potenziatore di segnale per 30 minuti e risciacquare con PBS.
4. Incubare le cellule con l'anticorpo monoclonale anti-vincolina a una diluizione di 1:250 in PBS per 45 minuti a RT. Quindi, lavare i substrati con PBS 3 volte (5 minuti ogni volta).
5. Incubare i campioni con l'anticorpo secondario Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG a una diluizione 1:200 in PBS a RT per 30 minuti. Lavare i substrati con PBS 3 volte (5 minuti ogni volta).
6. Per visualizzare la struttura della F-actina, incubare le cellule con coniugati falloidinici TRITC a una concentrazione di 50 μg/ml per 45 minuti a RT. Quindi, lavare i substrati con PBS 3 volte (5 minuti ogni volta).
7. Visualizzare i campioni utilizzando un microscopio laser a scansione confocale (Figura 1A-1D).

Risultati

Figura 1. Colorazione immunofluorescente di F-actina e vinculina su substrati di gel molle e polistirene duro.Nessuna fibra di actina era presente nella cellula tumorale meno diffusa (A1) o nella cellula normale (A2) su gel morbidi da 2 kPa. Tuttavia, le aderenze focali puntate contenenti vinculina sono presenti sui gel morbidi (B1-B2).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagenti
Pbs	Lonza	17-516F
Paraformaldeide	Scienze della microscopia elettronica	RT15710
Potenziatore di segnale	Tecnologie di vita	I36933
Anticorpo monoclonale anti vinculina	Sigma-Aldrich	V9131
Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG	Tecnologie di vita	Codice: A11001
Coniugati falloidinici TRITC	Sigma-Aldrich	P1951
materiali
vetrini in vetro da 12 mm2	Corning	Codice 2865-12