Saggio di organizzazione del citoscheletro e dell'adesione focale: un metodo basato sull'immunofluorescenza per studiare l'adesione cellulare e la diffusione su substrati

1. Saggi di microscopia a immunofluorescenza

1. Portare i substrati con le cellule da immunocolorare sulla cappa laminare e rimuovere il terreno di coltura.
2. Sciacquare i substrati con PBS e fissare le cellule con paraformaldeide al 4% in PBS per 20 minuti a RT.
3. Lavare i substrati con PBS tre volte (5 minuti ogni volta). Di conseguenza, incubare i substrati con 500 μl di potenziatore di segnale per 30 minuti e risciacquare con PBS.
4. Incubare le cellule con l'anticorpo monoclonale anti-vincolina a una diluizione di 1:250 in PBS per 45 minuti a RT. Quindi, lavare i substrati con PBS 3 volte (5 minuti ogni volta).
5. Incubare i campioni con l'anticorpo secondario Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG a una diluizione 1:200 in PBS a RT per 30 minuti. Lavare i substrati con PBS 3 volte (5 minuti ogni volta).
6. Per visualizzare la struttura della F-actina, incubare le cellule con coniugati falloidinici TRITC a una concentrazione di 50 μg/ml per 45 minuti a RT. Quindi, lavare i substrati con PBS 3 volte (5 minuti ogni volta).
7. Visualizzare i campioni utilizzando un microscopio laser a scansione confocale (Figura 1A-1D).

Figura 1. Colorazione immunofluorescente di F-actina e vinculina su substrati di gel molle e polistirene duro.Nessuna fibra di actina era presente nella cellula tumorale meno diffusa (A1) o nella cellula normale (A2) su gel morbidi da 2 kPa. Tuttavia, le aderenze focali puntate contenenti vinculina sono presenti sui gel morbidi (B1-B2). Al contrario, le cellule primarie mostrano una morfologia ben diffusa, fibre di stress actina ben definite (C1-C2) e adesioni focali allungate discrete (D1-D2) su substrati rigidi di polistirene.