Batterica analisi di espressione genica mediante microarray

Protocol

La reazione della trascrittasi inversa

Girare blocco riscaldamento a 70-80 ° C e 42 ° C. Bagni di acqua può essere utilizzata anche in questo passaggio. Se si utilizza blocchi di riscaldamento, mettere un po 'd'acqua in modo che il calore è uniforme.

1. Adescamento di reazione
   1. Prendete 3 g di RNA
   2. Regolare il volume a 13 microlitri con acqua RNasi libero
   3. Aggiungere 2,5 ml di casuale esamero primer (2mg/ml)
2. Mescolare bene e incubare a 70-80 ° C per 8 minuti. Poi, posto in ghiaccio per 5 min.
3. RT preparare cocktail (14,5 microlitri / RXN):
   
   

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AA-dUTP		Sigma-Aldrich	A0410	5-(3-amminoallil)-2' deossiuridina-5'-trifosfato
dNTP		Amersham	27-2035-01	100 mM dNTP Set Primer
	Hexamer casuali	Amersham	27-2166-01	3mg/mL
SuperScript III RT		Invitrogen	80800444	200U/μ L
CyDye™		Amersham	RPN5661	Confezione di colorante reattivo post-etichettatura
QIAquick		Qiagen	28104	Kit di purificazione PCR
1 M K2HPO4
1 M KH2PO4
1 M Tampone			KPO4	Per creare un tampone fosfato 1M (KPO4, pH 8,5-8,7) combinare: 9,5 mL 1M K2HPO4 e 0,5 ml 1M KH2PO4
Tampone di lavaggio fosfato	Per			100 mL di tampone di lavaggio fosfato (5 mM KPO4, pH 8,0, 80% EtOH) miscelare: 0,5 ml 1 M KPO4 pH 8,5 + 15,25 mL di acqua MilliQ + 84,25 mL di etanolo al 95%. Il tampone di lavaggio sarà leggermente torbido.** IMPORTANTE: Il tampone di lavaggio al fosfato deve essere preparato quotidianamente.
Tampone di eluizione del fosfato	Tampone			Diluente 1 M KPO4, pH da 8,5 a 4 mM con acqua sterile
			carbonato di sodio	(Na2CO3): 0,5 M, pH 9,0. Sciogliere 4,2 g di NaHCO3 in 80 mL di acqua sterile e regolare il pH a 9,0 con 10 N NaOH; portare il volume fino a 100 ml con acqua sterile. Per ottenere una soluzione di 50 mM per la reazione di accoppiamento del colorante, diluire 1:10 con acqua. Nota: il tampone carbonato cambia composizione nel tempo; Preparalo fresco ogni due settimane o un mese.