Batterica analisi di espressione genica mediante microarray

Protocollo

La reazione della trascrittasi inversa

Girare blocco riscaldamento a 70-80 ° C e 42 ° C. Bagni di acqua può essere utilizzata anche in questo passaggio. Se si utilizza blocchi di riscaldamento, mettere un po 'd'acqua in modo che il calore è uniforme.

1. Adescamento di reazione
   1. Prendete 3 g di RNA
   2. Regolare il volume a 13 microlitri con acqua RNasi libero
   3. Aggiungere 2,5 ml di casuale esamero primer (2mg/ml)
2. Mescolare bene e incubare a 70-80 ° C per 8 minuti. Poi, posto in ghiaccio per 5 min.
3. RT preparare cocktail (14,5 microlitri / RXN):
   
   

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
AA-dUTP		Sigma-Aldrich	A0410	5-(3-aminoallyl)-2’deossiuridina-5’-trifosfato
dNTP		Amersham	27-2035-01	Set di dNTP 100 mM, grado PCR
Primer Esameri Casuali		Amersham	27-2166-01	3 mg/mL
SuperScript III RT		Invitrogen	80800444	200 U/μL
CyDye™		Amersham	RPN5661	Kit di coloranti reattivi per post-etichettatura
QIAquick		Qiagen	28104	Kit di purificazione PCR
1 M K2HPO4
1 M KH2PO4
1 M KPO4	Tampone			Per preparare un tampone fosfato 1 M (KPO4, pH 8,5-8,7), mescolare: 9,5 mL di K2HPO4 1 M e 0,5 mL di KH2PO4 1 M
Tampone di lavaggio fosfato	Tampone			Per 100 mL di tampone di lavaggio fosfato (5 mM KPO4, pH 8,0, 80% EtOH), mescolare: 0,5 mL di KPO4 1 M pH 8,5 + 15,25 mL di acqua MilliQ + 84,25 mL di etanolo al 95%. Il tampone di lavaggio risulterà leggermente torbido. **IMPORTANTE: il tampone di lavaggio fosfato deve essere preparato ogni giorno.
Tampone di eluizione fosfato	Tampone			Diluire il KPO4 1 M, pH 8,5, a 4 mM con acqua sterile
Tampone di carbonato di sodio				(Na2CO3): 0,5 M, pH 9,0. Sciogliere 4,2 g di NaHCO3 in 80 mL di acqua sterile e portare il pH a 9,0 con NaOH 10 N; portare il volume a 100 mL con acqua sterile. Per ottenere una soluzione 50 mM da usare nella reazione di accoppiamento del colorante, diluire 1:10 con acqua. Nota: il tampone carbonato cambia composizione nel tempo; prepararlo fresco ogni due settimane o mese.