Articolo metodologico
Pseudofracture, un modello riproducibile murino di sterili traumi muscolo-scheletrici, permette per la valutazione di fine periodo risposta immunitaria post-traumatico. Questo articolo descrive l'esecuzione procedurale del modello passo dopo passo, compresa la possibilità di combinazioni modello sperimentale di permesso di studio di traumi multipli.
A seguito di un trauma è uno dei primi iper-reattiva risposta infiammatoria che può portare a disfunzione d'organo multipla e alta mortalità nei pazienti con trauma, questa risposta è spesso accompagnata da una immunosoppressione ritardato che aggiunge le complicazioni cliniche di infezione e può anche aumentare la mortalità 1-9. Molti studi hanno cominciato a valutare questi cambiamenti nella reattività del sistema immunitario dopo un trauma. 10-15
Gli studi immunologici sono fortemente sostenute attraverso la grande varietà di transgenici e topi knockout per la modellazione in vivo;. Aiuto di questi ceppi nelle indagini dettagliate per valutare i meccanismi molecolari coinvolti nella risposta immunologica 16-21
La sfida di modellazione trauma sperimentale murino è un'indagine a lungo termine, come le tecniche di fissazione della frattura nei topi, può essere complesso e non facilmente riproducibili. 22-30
Questo modello pseudofracture, un modello di trauma facilmente riproducibili, supera queste difficoltà, immunologicamente mimando un ambiente frattura degli arti, consentendo libertà di movimento per gli animali e la sopravvivenza a lungo termine senza il continuo, l'uso prolungato di anestesia. L'intento è quello di ricreare le caratteristiche delle fratture delle ossa lunghe; muscoli feriti e dei tessuti molli sono esposti a osso danneggiato e midollo osseo senza rompere l'osso nativo.
Il modello pseudofracture compone di due parti: un accordo bilaterale di lesione da schiacciamento muscolare alla arti posteriori, seguito da iniezione di una soluzione di osso in questi muscoli feriti. La soluzione osso è preparata dalla raccolta delle ossa lunghe da entrambe le zampe posteriori di età e peso corrispondenti donatore singenici. Queste ossa vengono poi pigiate e risospesi in tampone fosfato per creare la soluzione di osso.
Frattura del femore bilaterale è un modello di uso comune e consolidata di traumi degli arti, ed è stato il modello comparativo durante lo sviluppo del modello pseudofracture. Tra le varietà di modelli di frattura a disposizione, abbiamo scelto di utilizzare un metodo chiusa di frattura con lesione dei tessuti molli come il nostro confronto al pseudofracture, come volevamo una sterile ancora proporzionalmente grave trauma dei tessuti periferici modello. 31
Shock emorragico è un reperto comune nel contesto di gravi traumi, e l'ipoperfusione globale aggiunge un elemento molto rilevante per un modello di trauma. Pseudofracture 32-36 Il modello può essere facilmente abbinato ad un modello di shock emorragico per un modello di traumi multipli di gravità elevata 37.
1. Strumento e preparazione del campo chirurgico:
Tutte le procedure sperimentali sono eseguite utilizzando tecniche asettiche. Prima di iniziare, l'area sperimentale deve essere accuratamente puliti e sterilizzati. Il banco deve essere disinfettati, lasciati asciugare all'aria e poi pulito con alcool al 70%. Posizionare un tampone chirurgico blu e il campo sterile spogliatoio nell'area di lavoro sperimentale.
Tutti i materiali e gli strumenti sono sterilizzati in autoclave prima dell'uso. Siringhe e aghi sterili vengono ricevuti. Il ricercatore deve essere opportunamente vestito di camice, mascherina e guanti chirurgici sterili.
I nostri strumenti chirurgici vengono sterilizzati in autoclave ogni sera. Vengono lavate dopo l'intervento chirurgico con sapone antibatterico e acqua. Essi sono autorizzati ad asciugare su una superficie pulita tampone chirurgico blu. Sono poi accuratamente inseriti in un sacchetto di sterilizzazione e sterilizzato per un uso successivo.
Accendere lo sterilizzatore a caldo tallone per assicurarsi che raggiunge la temperatura appropriata - 300-350 ° C prima di iniziare l'esperimento. Questo sterilizzatore saranno utilizzati per pulire gli strumenti tra le procedure sperimentali sui topi rispettivi proprietari. Prendi un vassoio degli strumenti in acciaio inox e riempire 1 / 3 del modo con il 70% di etanolo. Ci dovrebbe essere abbastanza etanolo al 70% per coprire i vostri strumenti chirurgici. Accendere il riscaldamento pad circolare e mettere un tampone chirurgico blu sopra e poi un campo sterile condimento per di più. Questa stufa è utilizzato per garantire calore adeguata del mouse durante la procedura sperimentale e periodo di recupero. Mettere tutti gli strumenti sterili, garze, siringhe, aghi e una provetta per microcentrifuga 1,5 ml sul campo la medicazione sterile. Fare attenzione quando si aprono gli strumenti sterili ed altri articoli, non per contaminarli toccandoli. E 'meglio usare guanti sterili quando si fa questa procedura di configurazione.
2. Pseudofracture Modello - Procedure sperimentali:
1. Induzione dell'anestesia e il posizionamento del mouse.
Iniziare con la somministrazione di un'iniezione intraperitoneale di Pentobarbitol (70mg/kg). Questo si realizza in primo luogo il sollevamento con il mouse dalla gabbia con l'estremità prossimale della sua coda. Il mouse deve essere poi pesato per calcolare il corretto dosaggio di anaesthesic. Quindi, posto che l'animale in cima alla gabbia, mentre ancora in mano la coda. Afferra la collottola del mouse con il pollice e il medio su entrambi i lati del mouse appena dietro le zampe anteriori. Il dito indice è utilizzato per tirare la pelle sulla testa / collo regione schiena e in parte immobilizzare la testa. La coda del topo si tiene tra il mignolo e l'anulare, mentre l'anulare è premuto nella regione lombare della colonna vertebrale del mouse. L'anestesia dovrebbe prendere pieno effetto in circa 5 minuti, e dovrebbe essere confermata con il test di riflesso.
Dopo che l'animale è addormentato, posizionare il mouse in posizione supina su una tavola di plexiglass e utilizzare una tecnica di nastro allentato ciclo per immobilizzare le loro estremità con nastro adesivo. La tecnica comporta ciclo perdere semplicemente tagliando sottili strisce di nastro e avvolgere il nastro liberamente attorno alla porzione distale di ogni estremità. Il nastro viene poi bloccato a se stessa e la sinistra su nastro è attaccato alla tavola. Questo permette la manipolazione sperimentale da eseguire in modo coerente oltre ad assicurare le estremità dei topi assumere una posizione più naturale. Regioni addominale, inguinale, e sulla coscia dell'animale vengono poi rasate utilizzando i nostri tagliatori Oster A5 (taglia 40 lama), per aiutare a mantenere un campo sterile. Una garza 4x4 è cosparso con Betadine e l'area chirurgica viene poi spazzata da sterilizzare. Una medicazione campo sterile viene poi piegato e coperto attraverso il mouse per consentire l'esposizione dei soli arti inferiori e alla testa.
Dopo l'immobilizzazione e la sterilizzazione, luogo un'ogiva con isoflurano sul naso del mouse per alcuni secondi prima di iniziare la procedura sperimentale. Il cono è costituito da un tubo 50cc conica riempita con una garza. La metà delle estremità inferiore del tubo è tagliato fuori creare uno spazio per il naso del mouse per adattarsi. Un berretto (inferiore di un tessuto di stoccaggio contenitore cioè direttamente barattolo bocca laterale di larghezza) è collocato sull'estremità taglio delle coniche per assicurare i vapori isoflurano rimanere nel tubo quando non in uso. Un ml di isoflurano dovrebbe essere aggiunta la garza all'interno del cono. Meticolosa attenzione dovrebbe essere prestata al mouse durante l'uso di anestesia e in particolare l'uso di isoflurano attraverso il cono di naso. Una volta respirazione degli animali cominciano a rallentare, l'esperimento può iniziare, e il cono di naso dovrebbe essere rimosso e chiuso.
Se l'anestesia è necessario ulteriore corso di qualsiasi parte dell'esperimento, pentobarbital supplementare può essere iniettato o isoflurano somministrata. Metodi alternativi di amministrazione isofluorane sono disponibili e aggiornate le linee guida raccomfine l'uso di un vaporizzatore di precisione per consentire un migliore controllo di anestesia, se possibile. Tuttavia, attenzione alla fisiologia respiratoria del mouse deve essere garantita con uno di questi metodi.
2. Pseudofracture esperimento.
Pseudo-fratture è una combinazione di lesioni dei tessuti molli seguita da iniezione osso soluzione al muscolo infortunato e viene eseguita bilateralmente alle arti posteriori. La soluzione osso deve essere preparato prima di qualsiasi manipolazione sperimentale dei topi riceventi comincia.
3. La preparazione della soluzione ossa.
La soluzione osso preparata da un topo donatore sarà sufficiente per 3 topi riceventi. Un topo donatore singenici dovrebbe essere utilizzato che è l'età e al peso del mouse abbinato al destinatario sperimentale.
Il mouse donatore sarà eutanasia con isoflurano per via inalatoria. Il donatore sarà poi registrato alla scheda di plexiglass con particolare attenzione al nastro alle estremità inferiori solo alla punta del piede. L'estremità inferiore deve essere attentamente e accuratamente rasata coperta di Betadine, e poi pulito con alcool per la sterilità. Poi il femore e della tibia saranno rimossi chirurgicamente in modo sterile da entrambe le estremità inferiori. Per rimuovere le ossa lunghe dalle arti inferiori, fare una incisione chirurgica nella pelle nella regione inguinale, e continuano a tagliare la pelle per tutta la lunghezza degli arti, fino alla caviglia. Ritrarre la pelle, e sezionare lontano dalla fascia sottocutaneo e muscolare, sia sugli aspetti mediale e laterale per l'esposizione massima. Inserire una lama delle forbici sotto i muscoli che si trovano anteriore e laterale per il (tibiale anteriore, estensore lungo delle dita, estensore lungo del hallicus, peroneo lungo, peroneo breve) tibia e far scorrere la lama prossimale e distale di sollevare i muscoli pulito lontano dal osseo sottostante. Ripetete questa tecnica nella parte inferiore posteriore e mediale della tibia per separare i muscoli sotto la tibia (gastrocnemio, soleo, plantare, tibiale posteriore, flessore lungo delle dita, flessore lungo hallicus). Un minimo sforzo supplementare dovrebbe essere utilizzato sul lato posteriore scorrevole quando distalmente, al fine di far scattare la fibula di distanza dalla tibia. Alla fine prossimale di questi muscoli delle gambe tagliati i tendini il più vicino ai loro inserimenti possibile e ritirare la muscolatura distale, mentre tirando il gruppo muscolare insieme in modo verso il basso un rimorchiatore piccolo rilascerà gli allegati distale di questi muscoli dalla caviglia. L'articolazione della caviglia può essere tagliare direttamente con le forbici. Non staccare la tibia dal femore, a questo punto! Questo collegamento dà leva aggiuntiva che sarà di aiuto nella dissezione del femore dall'articolazione dell'anca. Seguire una tecnica simile per il rilascio dei muscoli del femore ed eseguire questo posteriormente e sia medialmente e lateralmente anche se necessario. Tagliare il fissaggio distale di questi gruppi muscolari di liberarli dal ginocchio. Continua la dissezione e seguire sotto i muscoli di sezionare la fine del femore fuori dell'articolazione dell'anca. Per facilitare questa dissezione, l'incisione cutanea dovrebbe essere estesa per quanto necessario per ottenere un'adeguata esposizione. Il movimento del femore alla articolazione dell'anca può aiutare a individuare l'estremità prossimale del femore durante la dissezione.
Una volta che il femore (con annesso tibia) viene rimossa dal donatore del mouse metterli su un 4x4gauze sterile. Le due ossa possono essere separati al ginocchio semplicemente afferrando ogni osso in una mano separata e delicatamente torsione / rotazione le due ossa in direzioni opposte lungo il loro asse longitudinale. Dissezione dolce e la gestione di queste due ossa è raccomandato in quanto possono essere facilmente fratturato con un eventuale eccesso di sforzo della manipolazione manuale. Per rimuovere gli allegati tendine rimanenti dalle ossa lunghe, utilizzare un pezzo di garza sterile asciutta 4x4 avvolto intorno alla lunghezza dell'osso. Afferrare questa garza stretta contro l'osso uno tirarlo per tutta la lunghezza dei tempi ossa varie, questo raschiare i tessuti rimanenti dalla superficie dell'osso in quanto saranno aderire al garza e di essere rapidamente e facilmente tirato via dalle ossa. Le ossa raccolte devono poi essere inseriti direttamente in una provetta sterile microcentrifuga 1,5 ml e poste in ghiaccio per il trasporto.
Questi quattro ossa del donatore sarà portato in una cappa di sicurezza biologica per la preparazione per la soluzione delle ossa. La cappa deve essere accuratamente disinfettato prima dell'uso, posizionare un campo sterile medicazione sopra l'area di lavoro all'interno della cappa. Posizionare un mortaio e pestello sterile, sterile tubo 8ml e fosfato sterile salina tamponata (PBS) nell'area di lavoro. Un 1mL pipetteman, e suggerimenti relativi dovrebbero essere disponibili entro il cofano.
Una coppia di pinze sterili deve essere usato per rimuovere le ossa raccolte in maniera sterile nella provetta per microcentrifuga 1,5 ml e collocato nel mortaio, il pestello sarà poi utilizzato per schiacciare leggermente le ossa. Phosphmangiato Buffered Saline è il veicolo utilizzato per sospendere di nuovo i frammenti ossei per l'iniezione. Pipettare 1 ml di PBS nel mortaio e continuare a schiacciare i frammenti rimanenti, con ulteriori movimenti circolari per garantire la risospensione completa. Quindi aggiungere un altro 1 ml di PBS e continuare schiacciamento per creare la 'soluzione osso'. La soluzione deve avere un colore rosa, e non ci saranno residui lasciati sul fondo del mortaio, che non può essere completamente rotto. Versare lentamente la soluzione fuori dal mortaio nella provetta 8ml, per catturare il volume massimo, garantendo al tempo stesso i resti più grandi rimangono indietro nel mortaio. Questa soluzione osso deve rimanere sul ghiaccio fino al suo uso sperimentale e sarà trasferito alle siringhe 1 ml per iniezione. Una ventina di gauge sarà poi attaccato alla siringa 1 ml contenente la soluzione osso al fine di amministrare al mouse. Questa dimensione ago di grande è stato scelto per garantire che tutti i frammenti ossei entrare nella regione a seguito di iniezione e non bloccare l'ago.
Prima dell'iniezione del mouse per destinatario, una goccia della soluzione di osso è collocato su una piastra di agar MacConkey per la cultura (24-incubazione per 48 ore). Questo per garantire la sterilità della soluzione osseo. Il pH della soluzione osso deve anche essere controllata per garantire un pH neutro.
4. Lesioni dei tessuti molli.
Questa lesione dei tessuti molli è un bilaterale lesione da schiacciamento degli arti posteriori. Il posizionamento iniziale del mouse, con arti posteriori leggermente rapiti e ruotato lateralmente, aiuta l'accessibilità rispetto al gruppo muscolare corretto, i flessori del ginocchio (bicipite femorale, semitendinoso e muscolo semimembranoso). Un hemostat grande 18 centimetri saranno utilizzati per eseguire la lesione da schiacciamento. La distribuzione della forza di questi hemostats applicata è stato analizzato e trovato per essere 270psi con Topaq Analysis System con sensore di pressione Products Inc. Il hemostat devono essere bloccati attorno alla muscolatura della coscia posteriore, punto medio lungo il femore, con la sua curva convessa verso il femore. Il hemostat dovrebbe poi essere bloccato chiuso al primo scatto unico, e rimanere per 30 secondi. Una grande attenzione al posizionamento di questa hemostat è importante - non devono essere bloccati sul femore, per assicurarsi che non si rompe. Questo è deve essere eseguita in modo coerente ogni volta a garantire un infortunio riproducibile tra topi. Questa lesione da schiacciamento viene eseguita su entrambi gli arti inferiori.
5. Osso soluzione iniettabile.
Il mouse destinatario sperimentali saranno anestetizzati e preparato come descritto in precedenza, e hanno subito lesioni dei tessuti molli prima di questa iniezione osso.
La soluzione di osso saranno poi iniettate nella muscolatura della coscia schiacciata del mouse destinatario bilateralmente. Utilizzando un ago di calibro 20, 0.15mL di questa soluzione verrà iniettato nei muscoli posteriori della coscia ciascuno. Inserire l'ago attraverso la pelle di circa 2 ~ 3 mm e prestare attenzione alla distanza di inserimento dell'ago - vi sentirete come la punta dello smusso tocca solo contro il femore, questa posizione è l'ideale. Iniettare la soluzione osso ora. L'ago e rapidamente posto un dito guantato sterile sul sito di iniezione per fermare ogni riflusso di soluzione osso dalla ferita. Tenere questo dito lì per alcuni secondi.
Il mouse sarà poi rimesso nella gabbia e ha permesso la piena libertà di movimento direttamente come sovvenzioni anestesia. Gestione del dolore appropriato deve essere somministrato come il mouse si risveglia.
6. Post-operative/recovery periodo.
Il nastro allentato ciclo viene rimosso e gli animali siano posti in una gabbia pulita, che è tenuta su una piastra elettrica in circolazione per diverse ore dopo il recupero. Calore appropriato dovrebbe essere assicurata con una lampada di calore supplementari.
Cibo e acqua saranno immediatamente disponibili.
Analgesico deve essere somministrato come gli animali cominciano a svegliarsi dall'anestesia al fine di gestire correttamente il dolore. Buprenorfina (0.1mg/kg) viene iniettato per via sottocutanea come gli animali iniziano l'attività fisica, ma non prima, in modo da non compromettere la funzione respiratoria.
I topi devono essere costantemente monitorati durante l'anestesia, fino al recupero dall'anestesia o endpoint sperimentale. I topi devono essere anche essere molto attentamente monitorati nel periodo post-operatorio e qualsiasi farmaco di dolore supplementare necessaria deve essere somministrata, se necessario. Monitorare l'attività fisica degli animali, lo stato delle vie respiratorie, l'assunzione di cibo e acqua e tutti i segni di disagio (respiro affannoso, dolore, cambiamenti nelle abitudini di bere e mangiare) devono essere inoltrate conseguenza.
Inserisci la tua strumenti chirurgici in 70% di alcol e pulire con garza sterile poi metterle in microbead lo sterilizzatore per circa 20 secondi per la sterilizzazione tra gli animali. Rimuovere gli strumenti chirurgici e spruzzare con alcool al 70% per aiutarli a rinfrescarsi. Metterli sulla °erile campo spogliatoio. Assicurarsi che non vi è alcuna alcol lasciato sugli strumenti che goccia di nuovo nel prossimo animali.
3. Comparativo bilaterale frattura del femore Modello - Procedure sperimentali:
Il mouse sperimentali saranno anestetizzati e preparato come inizialmente descritto. Un hemostat grande 18 centimetri deve essere fissata intorno al arti posteriori di circa 2-3mm sopra il ginocchio con la sua superficie convessa verso il ginocchio. Mettere il pollice sulla parte superiore del hemostat bloccato e il dito indice tra il hemostat e dell'anca. Assicurarsi di sentire il femore prima di torsione in modo da sapere dove si sta rompendo. Poi hemostat torsione in senso antiorario, mentre l'altra mano torsione in senso orario.
Ripetere la procedura con la gamba controlaterale.
4. Traumi multipli Modello - Procedura sperimentale per la combinazione di Pseudofracture con shock emorragico:
Topo destinatario saranno anestetizzati e preparato come inizialmente descritto. I topi che sono sottoposti a shock emorragico, in combinazione con pseudo-frattura avrà incannulazione dell'arteria femorale prima della procedura pseudofracture e poi sarà un'emorragia da questo catetere una volta che la pseudo-frattura è stata completata.
5. Segreti per il successo:
Generale:
Osso soluzione preparazione:
Lesioni dei tessuti molli:
Osso soluzione iniettabile:
6. Messaggio Preoccupazioni operativo:
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Pseudofracture, un modello riproducibile murino di sterili traumi muscolo-scheletrici, permette per la valutazione della risposta immunitaria post-traumatico. Il modello simula pseudofracture immunologicamente un ambiente frattura degli arti attraverso la ricreazione delle caratteristiche di una frattura delle ossa lunghe: muscoli feriti e dei tessuti molli sono esposti a danni alle ossa e midollo osseo, senza rompere l'osso nativo 38,39 bifasica Una risposta immunitaria può essere visto di seguito. traum...
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Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa e il comportamento di ricerca e Compliance Office dell'Università di Pittsburgh, un AALAS / AAALAC ente accreditato. Origine animale comprendono Jackson Laboratori e Charles Rivers Laboratories. Tutti gli animali sottoposti a garanzia estesa salute attraverso ogni fornitore così come l'Università di Pittsburgh programmi interni di polizia sanitaria di monitoraggio. Questa ricerca è condotta in conformità con i principi del governo degli Stati Uniti per l'utilizzo di animali vertebrati. Il programma viene registrato presso l'USDA, e ha una lettera di garanzia con l'Ufficio Public Health Service del benessere degli animali da laboratorio.
Fonte di finanziamento / Numero Biologia molecolare dello shock emorragico GM053789
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cuscinetto blu chirurgico | Fisher Scientific | 50-7105 | |
| Medicazioni da campo sterili | Fisher Scientific | NC9517505 | |
| Termoforo a circolazione 18"x26" | Harvard Apparatus | py872-5272 | |
| Sterilizzatore per strumenti a perline calde | VWR international | 11156-002 | |
| Vassoio in acciaio inossidabile 8" x 11" | VWR international | 62687-049 | |
| Pannelli in plexiglass (10x15x0,5cm) | Università di Pittsburgh Officina | ||
| Rotoli di nastro 1" | Corporate Express | MMM26001 | |
| tubo conico da 50 cc | Qualsiasi fornitore | ||
| Barattoli a bocca larga sul lato dritto (utilizzati come tappo per il cono del naso) | VWR international | 159000-058 | |
| Oster A5 Forbici con lama da 40 VWR | international | 10749-020 | |
| Forbici chirurgiche (dritte – 12 cm) | Strumenti per le scienze fini | 14068-12 | |
| Emostatici curvi -18 cm | Apparecchio per | 81331718 | |
| Harvard Pinze (punta da 0,8 mm, curva per 10 cm) | Strumenti per le scienze fini | 11050-10 | |
| Garza 4"x4" | Qualsiasi fornitore | ||
| Tubo per microfugo da 1,5 cc | Qualsiasi fornitore | ||
| Secchiello per il ghiaccio | Qualsiasi fornitore | ||
| Mortaio e pestello | Fisher Scientific | 12-961AA | |
| Siringa da 1 cc con ago da 25 G | Fisher Scientific | 14-826-88 | |
| Ago da 20 G | Qualsiasi fornitore | ||
| Pipettatore da 1 ml | Qualsiasi fornitore | ||
| Puntali per pipette da 1 ml | Qualsiasi fornitore | ||
| Falcon polistirene Provette da 8 ml | VWR international | 60819-331 | |
| Busta di sterilizzazione 3"x8" | VWR international | 24008 | |
| Busta di sterilizzazione 5"x10" | VWR international | 24010 | |
| MacConkey II Piastra Agar | BD Biosciences | 221172 | |
| Alcool etilico - 200 proof | Pharmco-AAPER | [70%] | |
| Pentobarbital Sodium (soluzione di sodio nembutol) | OVATION Pharmaceuticals | 70mg/kg | |
| Aerrane (Isoflurano) | Baxter Internationl Inc. | 99,9% | |
| Triadina Povidone Iodio (Betadina) | Triade monouso | ||
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | |||
| Buprenorfina HCl | Bedford Laboratories | 0,1mg/kg |
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