Fattori cellula ospite giocano un ruolo critico nella creazione e mantenimento di sarcoma di Kaposi (KS). Delineiamo metodi per identificare i fattori cellula ospite alterato nelle cellule DMVEC KSHV-infetti, e nel tessuto tumorale KS. Geni cellulari alterato da virus servirà come potenziale bersaglio (s) per nuove terapie.
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Articolo metodologico
Identificare i geni disregolazione indotta da sarcoma di Kaposi associato Herpesvirus (KSHV)
In questo articolo
Sommario
Abstract
Attualmente KS è la più predominante l'HIV / AIDS neoplasie correlate in Sud Africa e quindi il mondo. 1,2 Si caratterizza come un tumore angioproliferative delle cellule dell'endotelio vascolare e produce rare malattie linfoproliferative delle cellule B nella forma di linfomi versamento pleurico (PEL) e alcune forme di malattia multicentrica di Castleman. 3-5 solo 1-5% delle cellule KS lesioni sostenere attivamente la replicazione litica di associato al sarcoma di Kaposi herpesvirus (KSHV), l'agente eziologico associato con KS, ed è chiaro che fattori cellulari devono interagiscono con fattori virali nel processo di oncogenesi e progressione del tumore. 6,7 Identificare romanzo host-fattore determinanti che contribuiscono a KS patologia è essenziale per lo sviluppo di marcatori prognostici per la progressione del tumore e delle metastasi, nonché per lo sviluppo di nuove terapie per il trattamento del KS . 8 La dettagli del video che accompagna i metodi che utilizziamo per identificare i programmi della cellula ospite espressione genica nel derma cellule endoteliali microvascolari (DMVEC) dopo l'infezione KSHV e nel tessuto tumorale KS 9. Una volta che i geni disregolazione sono identificati con l'analisi microarray, i cambiamenti nell'espressione delle proteine sono confermata da immunoblot e doppia immunofluorescenza etichettati. Cambiamenti nell'espressione della trascrizione dei geni disregolazione sono confermati in vitro con quantitativi in tempo reale reazione a catena della polimerasi (QRT-PCR). Validazione dei risultati in vitro utilizzando archivio tessuto tumorale KS è eseguita da due immunochimica etichettati e microarray di tessuto. 8,10 Il nostro approccio per individuare i geni disregolazione nel microambiente tessuto tumorale KS permetterà lo sviluppo in vitro e successivamente in sistemi modello in vivo per la scoperta e la valutazione delle potenzialità terapeutiche nuove per il trattamento del KS.
Protocollo
1. KSVH Coltivazione e infezione di DMVEC
- La linea BCBL-1 delle cellule, originariamente isolato da un linfoma umano cavità del corpo a base, è colto in completo RPMI 1640 media (Gibco, Grand Island, NY). BCBL-1 le cellule vengono rimosse da azoto liquido, trasportati in ghiaccio secco, e presto scongelati per 1 minuto a 37 ° C. A 50 ml di aliquota BCBL-1 le cellule ad una densità di 1x10 4 cellule / ml è aggiunto a 500 ml di RPMI 1640 mezzi di comunicazione integrata con 10% siero di vitello fetale, 1x penicillina / streptomicina e distribuito in 175 fiaschi cm, a 50 mL / beuta .
- I palloni di BCBL-1 le cellule vengono poi incubate a 3....
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Discussione
Le metodologie utilizzate in questo rapporto possono essere eseguite in una varietà di impostazioni di laboratorio. Essi richiedono alcune apparecchiature speciali o l'accesso alle strutture di base. Precauzioni devono essere prese quando si fa esperimenti infettive agenti patogeni virali come KSHV che può richiedere l'uso di un livello biosaftey 3 (BSL-3) strutture. Acquisizioni tessuti devono essere approvate dai consigli appropriati revisione istituzionale (IRB).
Queste metodologi.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Ringraziamo James EK Hildreth, Meharry Medical College, per i suoi consigli e la revisione di questo manoscritto. Ringraziamo anche Diana Marver per l'editing del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Vanderbilt Meharry Centro per la ricerca sull'AIDS (NIH concedere AI054999 P30-05), il Centro per la Salute AIDS Research disparità, NIH concedere 5U54 RR019192-05; Meharry il Centro per la Ricerca Clinica, NIH di Grant P20RR011792 e dal NIH concedere P01 CA113239. DJA è stata in parte finanziata da sovvenzioni pilota della Vanderbilt-Meharry Centro per la ricerca sull'AIDS (CFAR) e il Centro Meharry per la Ricerca Clinica (CRC).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Invitrogen | 05-0001DJ | |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| PBS pH 7,4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| Butirrato di sodio | Sigma-Aldrich | 19364 (FLUKA) | |
| Mezzo EBM-2 | Lonza Inc. | CC-3156 | + integratore bullet kits |
| Celle DMVEC (HMVEC) | Lonza Inc. | CC2543 | |
| Siero fetale bovino | Hyclone | SH30066.03 | |
| Penicillina/streptomicina | Invitrogen | 15140-122 | |
| Vetrini con camera | Nalge Nunc international | 154461 | |
| KSHV LANA Mab | Vector Laboratories | VP-H913 | 1:50 diluizione/IFA |
| Galectina-3 pAb caprina | R&D Systems | AF1154 | |
| Donkey-anti-goat FITC | Jackson ImmunoResearch | 705-095-1 | |
| Donkey-anti-goat Rho | Jackson ImmunoResearch | 705-295-003 | 1:100 diluizione/IFA |
| Mezzo di montaggio | Vector Laboratories | H 1500 | Vectashield con DAPI |
| Kit per saggio proteico BCA | Pierce, Thermo Scientific | 23235 | |
| Nitrocellulosa | Bio-Rad | 161-0112 | |
| Donkey-anti-goat-coniugato | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC 2020 | |
| Substrato per Western | Pierce, Thermo Scientific | 34075 | |
| Biotina-coniglio-anti capra | Dako | 305-065-045 | |
| Coniugato AP-Streptavidina | Dako | K 0492 (kit) | |
| Set RNasi DNasi-free | Qiagen | 79254 | |
| MJ Mini Cycler | Bio-Rad | PTC-1148C | |
| Bio-Photometer | Eppendorf | 952000006 | |
| Centrifuga RC 6 Plus | Sorvall, Thermo Scientific | 46910 | |
| Centrifuga ultracentrifuga Coulter Optima L-90K | Beckman Coulter Inc. | 392052 | |
| Sistema di rilevamento PCR in tempo reale MYiQ iCycler | Bio-Rad | 170-9770 | |
| Microscopio fluorescente TE 2000S | Nikon Instruments | TE2000S | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2938C | |
| Eclipse E 200 | Nikon Instruments | E 200 | |
| Centrifuga Sorvall Legend RT | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 75004377 |
Riferimenti
- Sitas, F., Newton, R. Kaposi's sarcoma in South Africa. J Natl Cancer Inst Monogr. 28, 1-4 (2001).
- Moore, P. S., Chang, Y. Kaposi's sarcoma associated herpesvirus. Field's Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia, PA. 2803-2833 (2002).
- Chang, Y., Cesarman, E., Pessin, M. S., Lee, F., Culpepper, J.....
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Ristampe e permessi
