Al fine di esaminare l'espressione genica nel tessuto ala pupa di Bicyclus anynana, presentiamo un protocollo ottimizzato per ibridazioni in situ utilizzando riboprobes. Forniamo anche linee guida per l'ottimizzazione di questo protocollo per l'utilizzo in ali pupa di altre specie di lepidotteri.
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Articolo metodologico
Nel protocollo in situ per Ali di farfalla pupa Utilizzando Riboprobes
In questo articolo
Sommario
Abstract
Qui vi presentiamo, in formato video, un protocollo per ibridazioni in situ in pupa ali della farfalla Bicyclus anynana utilizzando riboprobes. In ibridazioni in situ, un pilastro della biologia dello sviluppo, sono utili per studiare i modelli spaziali e temporali di espressione genica nello sviluppo di tessuti a livello della trascrizione. Se gli anticorpi che colpiscono i prodotti proteici di trascrizione del gene non sono ancora stati sviluppati, e / o ci sono copie del gene multiple di una particolare proteina del genoma che non possono essere differenziate utilizzando anticorpi disponibili, in situs può essere utilizzato in sostituzione. Mentre un a tecnica in situ per dischi ala larvale è stato a disposizione della comunità farfalla per diversi anni, l'attuale protocollo è stato ottimizzato per le ali più grandi e più fragile pupa.
Protocollo
GIORNO 1
- Preparare le seguenti soluzioni:
- 10x PBS
- 1x PBS
- 1x PBT
- DDH 2 O
- Aggiungi DEPC per lo 0,1% del volume totale e scuotere vigorosamente le soluzioni.
- Autoclave.
- Fix paraformaldeide 4% - con PBS-DEPC
- Soluzione di proteinasi K - presenza di un precipitato, vortice vigorosamente prima di rimuovere aliquota
- Digestione di arresto Buffer
- Prehybridization Buffer
- 50:50 PBT: Buffer Prehybridization
- Tampone di ibridazione
- Le soluzioni devono essere tenuti RNasi-free. Utilizzare vetro-ware che è stato cotto (4 ore a 250 ° C) o di plastica usa e getta. Pipette sierologiche sono molto utili per la confezione di soluzioni
- Sezionare le ali di volta in scena pupe in PBS
- Spostare le ali direttamente per risolvere il problema del buffer in pozzi di 24 piastra di coltura bene a temperatura ambiente
- Fissare i dischi per 2 ore
- Lavare 5 x 5 minuti in PBT
- Incubare le ali per 3 minuti in soluzione proteinasi K
- Sciacquare 2 x nel tampone digestione di arresto
- Lavare 5 x 5 minuti in PBT
- Lavare 2 x 5 minuti 50:50 PBT: PHB
- Lavare 1 x 10 minuti in PHB
- Incubare in PHB almeno 1 ora a 55 ° C.
- Calore denaturare l'RNA sonda (20-50ng necessari per pozzetto) (80 ° C per 5 minuti) e aggiungere al tampone di ibridazione (100 ul necessaria per pozzetto)
- Aggiungi sonda pozzi e incubare 48 ore a 55 ° C
3 ° GIORNO
- Lavare 4 x 5 minuti a 55 ° C PHB
- Incubare per una notte in PHB a 55 ° C
GIORNO 4
- Preparare le seguenti soluzioni:
- Anticorpi Block Buffer
- Lavare 1 x 5 minuti 50:50 PBT: PHB
- Lavare 4 x 5 minuti in PBT
- Ali incubare per 1 ora nel tampone di blocco a 4 ° C
- Incubare le ali in una diluizione 1:2000 di anticorpi anti-Dig notte a 4 ° C
GIORNO 5
- Preparare le seguenti soluzioni:
- Rilevamento buffer
- Soluzione di sviluppo - (avvolgere in pellicola) sensibile alla luce
- Lavare 3 x 5 minuti in PBT a temperatura ambiente
- Lavare 7 x 5 minuti in PBT
- Lavare le ali due volte nel tampone di rilevamento
- Sviluppare le ali in 1 ml di soluzione in via di sviluppo - il tempo di sviluppo deve essere monitorato di volta in volta - i tempi di sviluppo possono cambiare anche quando si utilizza la stessa sonda e la soluzione di sviluppo - in genere controllo dopo 5-10 minuti e quindi aumentare gli intervalli fino a notte. Piastra deve essere avvolto in un foglio per evitare l'esposizione alla luce quando non controllo di campioni.
- Risciacquare cinque volte nel tampone di arresto in via di sviluppo
- Montare ali.
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Discussione
Ottimizzazione dei protocolli esistenti
In ibridazioni in situ su dischi ala larvali sono stati effettuati con successo con i dischi da Précis farfalle coenia (Carroll et al 1994;. Keys et al 1999;. Weatherbee et al 1999).. L'attuale protocollo è stato adattato da un protocollo dettagliato scritto disponibili su richiesta presso il Laboratorio Carroll colorazioni ala larvale. I cambiamenti che abbiamo fatto servono ad accogliere le differenze tra i tessuti ala larvale e pupale. Durante la pupa dissezioni hindwing, la membrana pe...
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Ringraziamenti
Ringraziamo Jayne Selegue, Margaret Hollingsworth, Jin Berry, Ryo Futahashi, Najmus Sahar Mahfooz, Aleksandar Popadic, Bob Reed, Roche supporto tecnico per assistenza per la risoluzione di questo protocollo. Ringraziamo anche William Piel per consigli su come modificare il film.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Buffer di fissazione | 4% Paraformaldeide in PBS | |||
| PBT | 0,1% Tween 20 in PBS | |||
| Soluzione di Proteinasi K | 2,5mg/ml Proteinasi K in PBT | |||
| Buffer di arresto della digestione | 2 mg/ml glicina in PBT | |||
| Buffer di pre-ibridazione | Per 50 ml di PHB: 12 ml di acqua trattata con DEPC + 25 ml di formammide + 12,5 ml di SSC 20x + 50 µl di Tween 20 + 500 µl di spermatozoi di salmone a 10 mg/ml (privo di Rnasi, denaturato termicamente prima dell'aggiunta alla soluzione). | |||
| Buffer di ibridazione | Aggiungere glicogeno a 1 mg/ml al buffer di pre-ibridazione | |||
| Buffer di blocco | 50 mM Tris pH 6,8, 150 mM NaCl, 0,5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA | |||
| Anti-DIG | Ab | Roche Group | 11 093 274 910 | Coniugato con fosfatasi alcalina |
| Kit di buffer per lavaggio e blocco con DIG | Roche Group | 11 585 762 001 | ||
| Mezzo di montaggio acquoso Crystal Mount | Sigma-Aldrich | C0612 | Mezzo di montaggio |
Riferimenti
- Carroll, S. B., Gates, J., Keys, D. N., Paddock, S. W., Panganiban, G. E. F., Selegue, J. E., Williams, J. A. Pattern formation and eyespot determination in butterfly wings. Science. 265, 109-114 (1994).
- Chomczynski, P. Solubilization in formamide protects RNA from degradation. Nucleic Acids Research. 20, 3791-3792 (1992).
- Keys, D. N., Lewis, D. L., Selegue, J. E., Pearson, B. J., Goodrich, L. V., Johnson, R. J., Gates, J., Scott, M. P., Carroll, S. B. Recruitment of a hedgehog regulatory circuit in butterfly eyespot evolution. Science. 283, 532-534 (1999).
- Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germ line transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc R Soc Lond B (Suppl). 271, S263-S265 (2004).
- Monteiro, A., Glaser, G., Stockslagger, S., Glansdorp, N., Ramos, D. M. Comparative insights into questions of lepidopteran wing pattern homology. BMC Developmental Biology. 6, 52(2006).
- Ramos, D. M., Kamal, F., Wimmer, E. A., Cartwright, A. N., Monteiro, A. Temporal and spatial control of transgene expresson using laser induction of the hsp70 promoter. BMC Developmental Biology. 6, 55(2006).
- Weatherbee, S. D., Nijhout, H. F., Grunert, L. W., Halder, G., Galant, R., Selegue, J., Carroll, S. Ultrabithorax function in butterfly wings and the evolution of insect wing patterns. 9, 109-115 (1999).
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Ristampe e permessi
