Nel protocollo in situ per Ali di farfalla pupa Utilizzando Riboprobes

Sommario

Al fine di esaminare l'espressione genica nel tessuto ala pupa di Bicyclus anynana, presentiamo un protocollo ottimizzato per ibridazioni in situ utilizzando riboprobes. Forniamo anche linee guida per l'ottimizzazione di questo protocollo per l'utilizzo in ali pupa di altre specie di lepidotteri.

Abstract

Qui vi presentiamo, in formato video, un protocollo per ibridazioni in situ in pupa ali della farfalla Bicyclus anynana utilizzando riboprobes. In ibridazioni in situ, un pilastro della biologia dello sviluppo, sono utili per studiare i modelli spaziali e temporali di espressione genica nello sviluppo di tessuti a livello della trascrizione. Se gli anticorpi che colpiscono i prodotti proteici di trascrizione del gene non sono ancora stati sviluppati, e / o ci sono copie del gene multiple di una particolare proteina del genoma che non possono essere differenziate utilizzando anticorpi disponibili, in situs può essere utilizzato in sostituzione. Mentre un a tecnica in situ per dischi ala larvale è stato a disposizione della comunità farfalla per diversi anni, l'attuale protocollo è stato ottimizzato per le ali più grandi e più fragile pupa.

Protocollo

GIORNO 1

1. Preparare le seguenti soluzioni:
   • 10x PBS
   • 1x PBS
   • 1x PBT
   • DDH ₂ O
     • Aggiungi DEPC per lo 0,1% del volume totale e scuotere vigorosamente le soluzioni.
     • Autoclave.
   • Fix paraformaldeide 4% - con PBS-DEPC
   • Soluzione di proteinasi K - presenza di un precipitato, vortice vigorosamente prima di rimuovere aliquota
   • Digestione di arresto Buffer
   • Prehybridization Buffer
   • 50:50 PBT: Buffer Prehybridization
   • Tampone di ibridazione
     • Le soluzioni devono essere tenuti RNasi-free. Utilizzare vetro-ware che è stato cotto (4 ore a ....

Discussione

Ottimizzazione dei protocolli esistenti

In ibridazioni in situ su dischi ala larvali sono stati effettuati con successo con i dischi da Précis farfalle coenia (Carroll et al 1994;. Keys et al 1999;. Weatherbee et al 1999).. L'attuale protocollo è stato adattato da un protocollo dettagliato scritto disponibili su richiesta presso il Laboratorio Carroll colorazioni ala larvale. I cambiamenti che abbiamo fatto servono ad accogliere le differenze tra i tessuti ala larvale e pupale. Durante la pupa dissezioni hindwing, la membrana pe.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Buffer di fissazione				4% Paraformaldeide in PBS
PBT				0,1% Tween 20 in PBS
Soluzione di Proteinasi K				2,5mg/ml Proteinasi K in PBT
Buffer di arresto della digestione				2 mg/ml glicina in PBT
Buffer di pre-ibridazione				Per 50 ml di PHB: 12 ml di acqua trattata con DEPC + 25 ml di formammide + 12,5 ml di SSC 20x + 50 µl di Tween 20 + 500 µl di spermatozoi di salmone a 10 mg/ml (privo di Rnasi, denaturato termicamente prima dell'aggiunta alla soluzione).
Buffer di ibridazione				Aggiungere glicogeno a 1 mg/ml al buffer di pre-ibridazione
Buffer di blocco				50 mM Tris pH 6,8, 150 mM NaCl, 0,5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA
Anti-DIG	Ab	Roche Group	11 093 274 910	Coniugato con fosfatasi alcalina
Kit di buffer per lavaggio e blocco con DIG		Roche Group	11 585 762 001
Mezzo di montaggio acquoso Crystal Mount		Sigma-Aldrich	C0612	Mezzo di montaggio