Isolamento Axoplasm da Nerve Rat sciatico

Summary

Dimostriamo un protocollo per l'isolamento axoplasm da nervo sciatico ratto adulto sulla base di dissezione di fasci nervosi e l'incubazione in media ipotonica per liberare mielina e lisare non assonale strutture, seguita da estrazione del restante assone arricchito di materiale.

Abstract

Isolamento di puro citoplasma assonale (axoplasm) dal nervo periferico è di fondamentale importanza per gli studi biochimici di molti processi biologici. In questo articolo, dimostrare e descrivere un protocollo per l'isolamento axoplasm dal nervo sciatico ratto adulto basato sui seguenti passi: (1) dissezione dei fasci nervosi e la separazione del tessuto connettivo, (2) incubazione di brevi segmenti di fasci nervosi nel medio ipotonica a rilasciare mielina e lisare non assonale strutture; e (3) estrazione dei rimanenti assone arricchito materiale. Proteomica e caratterizzazione biochimica di questa preparazione ha confermato un alto grado di arricchimento per i componenti assonale.

Protocol

Questo protocollo permette di isolare axoplasm con minimizzazione di contaminazione di tessuti gliali e vascolari. Il metodo produce circa 70-100 proteina axoplasm totale mcg per uno 8-10 vecchio topo settimana Wistar.

1. Sezionare nervi sciatico

1. Euthanize due ratti da CO ₂ inalazione seguita da dislocazione cervicale. Confermare la morte per la palpazione per mancanza di battito cardiaco prima di dissezione all'inizio.
2. Strofinare l'area dissezione con il 70% di etanolo.
3. Taglio, muscoli pelle separare e isolare nervo sciatico con le forbici e pinze con attenzione senza danneggiare i vasi sanguigni....

Discussion

Analisi biochimiche e proteomiche hanno confermato che questa procedura riduce la contaminazione delle cellule gliali siero e ³ rispetto ai metodi precedentemente descritti per l'isolamento axoplasm dalla stretta meccanica ^1. Abbiamo usato questo protocollo axoplasm isolamento di esplorare dineina basato segnalazione retrograda dopo la lesione del nervo sciatico ^2, e si aspettano di avere utilità nell'esplorazione di molti altri processi in adulti nervi periferici, tra cui assone.......

Materials