L'effetto di rigidità substrati sulla funzione cellulare può essere modellato In vitro Utilizzando idrogel di poliacrilamide di varia conformità.
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Articolo metodologico
Studiare gli effetti di rigidità Matrix sulla funzione cellulare utilizzando acrilamide a base di idrogeli
In questo articolo
Sommario
Abstract
Rigidità del tessuto è un importante determinante della funzione cellulare, e cambiamenti nella rigidità dei tessuti sono comunemente associati con fibrosi, cancro e malattie cardiovascolari 1-11. Approcci tradizionali cellule biologiche per studiare la funzione cellulare coinvolgono le cellule coltura su un substrato rigido (piatti di plastica o vetro coprioggetto) che non possono spiegare l'effetto di un ECM elastico o le variazioni di rigidezza ECM tra i tessuti. Per modellare condizioni in vivo nel rispetto dei tessuti in vitro, noi e altri usano ECM rivestite idrogel. Nel nostro laboratorio, l'idrogel si basano su poliacrilammide che possono mimare la gamma di conformità dei tessuti biologicamente visto 12. "Reattiva" coprioggetto sono generati da incubazione con NaOH seguita da aggiunta di 3-APTMS. Glutaraldeide è usato per cross-link del 3-APTMS e il gel di poliacrilammide. Una soluzione di acrilamide (AC), bis-acrilamide (Bis-AC) e persolfato di ammonio è usato per la polimerizzazione degli idrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) è incorporato nella soluzione CA per proteine crosslink ECM per l'idrogel. A seguito di polimerizzazione del idrogel, la superficie del gel è rivestita con una proteina ECM di scelta, come fibronectina, vitronectina, collagene, ecc
La rigidità di un idrogel può essere determinato da reologia o microscopia a forza atomica (AFM) e regolata variando la percentuale di AC e / o bis-CA nella soluzione di 12. In questo modo, la rigidità substrato può essere abbinata alla rigidità dei tessuti biologici che può anche essere quantificato mediante reologia o AFM. Le celle possono poi essere seminato in questi idrogel e colti sulla base delle condizioni sperimentali richieste. Imaging delle cellule e il loro recupero per l'analisi molecolare è semplice. Per questo articolo, si definisce substrati morbidi come quelli che hanno moduli elastici (E) <3000 Pascal e substrati rigidi / tessuti come quelli con E> 20.000 Pascal.
Protocollo
Preparazione
- Coprioggetto devono essere sterilizzati in autoclave.
- Acqua distillata o deionizzata deve essere utilizzato per preparare le soluzioni e per coprioggetto lavaggio.
- AC (40% w / v) e bis-CA (1% w / v) le soluzioni sono sterilizzate di 0,2 micron di filtrazione. Preparare persolfato di ammonio al 10% (APS; acqua 100μg/ml) poco prima dell'uso e filtro sterile. Sostituire la soluzione APS mensile.
- Reagenti chimici come 3-APTMS, cloroformio, glutaradehyde, NHS, e SurfaSil che non possono essere sterilizzati in autoclave sono conservati in una bottiglia assegnato utilizzati esclusivamente per la preparazione di idrogeli.....
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Discussione
Un elemento cruciale del processo di polimerizzazione idrogel è quello di evitare la formazione di bolle d'aria che consentono alle cellule di legarsi al coprioggetto di vetro piuttosto che l'ECM rivestite stesso idrogel. Ciò può essere evitato con cura di pipettaggio la soluzione di polimerizzazione dopo vortex e visivamente fare in modo che bolle d'aria sono intrappolati nel gel. Noi consigliamo sempre la preparazione aggiuntiva "a caldo" coprioggetto e idrogeli per assicurare avere abbastanza pe.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Il lavoro è il nostro laboratorio è supportato anche da finanziamenti del National Institutes of Health.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Glutaraldeide, 70% | Sigma-Aldrich | G7776 | Conservare a -20°C |
| 3-APTMS (3-aminopropiltrimetossisilano 97%) | Sigma-Aldrich | 281778 | Conservare a temperatura ambiente |
| SurfaSil, liquido silanizzante | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 42800 | Conservare a temperatura ambiente |
| NHS (ester N-idrossisuccinimidico) | Sigma-Aldrich | A-8060 | Conservare a 4°C. Sostituire mensilmente |
| Albumina da siero bovino, praticamente priva di acidi grassi | Sigma-Aldrich | A6003-100G | Conservare a 4°C |
| Coverslip (25 mm) | Fisher Scientific | 12-545-86 25 Cir 1D | |
| Coverslip (18 mm) | Fisher Scientific | 12-545-84 18 Cir 1D |
Riferimenti
- Beattie, D., Xu, C., Vito, R., Glagov, S., Whang, M. C. Mechanical analysis of heterogeneous, atherosclerotic human aorta. J Biomech Eng. 120, 602-607 (1998).
- Bernini, G. Arterial stiffness, intima-media thickness and carotid artery fibros....
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Ristampe e permessi
