Doppia fluorescenza In situ nelle sezioni cervello fresco

Sommario

Questo protocollo comporta un non radioattivo In situ procedura che consente l'identificazione simultanea di due specie di trascrizione, ad una risoluzione singola cella, in sezioni sottili del cervello dei vertebrati.

Abstract

Qui si descrive una versione modificata di una fluorescenza doppio

Protocollo

Questo protocollo è stato sviluppato e raffinato basato sullo standard radioattivi e non radioattivi in situ metodi di ibridazione, in precedenza sviluppato da noi e gli altri di individuare uno o due specie di trascrizione nel tessuto cerebrale ^1-7. Il protocollo descritto di seguito ha una lunghezza totale di 2 o 3 giorni, a seconda del numero di interruzioni procedurale scelto dall'utente finale. Tutti i passaggi dettagliati di seguito sono essere condotte a temperatura ambiente, con l'eccezione della fase di ibridazione riboprobe e post-ibridazione lavaggi. Le soluzioni e buffer richiesto per tutti i passi necessari per questo metodo si posson....

Discussione

Abbiamo usato questo protocollo per studiare come il cervello dei vertebrati è neurochemically e funzionalmente organizzato, e per determinare come comportamentale rilevante per l'impatto sensoriale stimoli il meccanismo genomico dei neuroni nel cervello adulto ^8-10. Abbiamo utilizzato con successo questo metodo nel tessuto cerebrale di topi, ratti e uccelli canori, ma prevediamo che questo protocollo sarà facilmente adattabile alle sezioni del cervello ottenute da una serie di specie di vertebrati e, for.......

Materiali

Soluzioni

1. Colonna del buffer di lavaggio: 10 mM Tris-HCl 0,15 M NaCl, 0,05 mM EDTA, 50 mg / tRNA microlitri, 0,1% SDS in 50 ml DEPC-acqua trattata.
2. Colonna tampone di bloccaggio: 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA in 50 ml DEPC-acqua trattata.
3. TNT buffer: 60 ml di 1 M Tris-HCl, 18 ml di NaCl 5 M e 1,8 ml di Triton X-100 in 600 ml di DEPC trattati con acqua.
4. TNB buffer: 100 mM Tris-HCl, 8.3 mg / microlitri BSA, 0,15 M di NaCl e il 3% Triton X-100 in DEPC trattati con acqua.
5. TE buffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 e 1 mM EDTA, pH 7,5.
6. Acetilazione soluzione: 2,7 ml di trietanolammina più 0,5 ml di anidride acetica in 200 ml di DEPC trattati con acqua.
7. Ibridazione soluzione: il 50% formammide, 2X SSPE, 2 mg / tRNA microlitri, 1 mg / BSA microlitri e 1 mg / mL poli A in acqua DEPC-trattata. Ha bisogno di 16 l per sezione.