Articolo metodologico

Fabbricazione di derivazione biologica Materiali iniettabili per l'ingegneria tissutale miocardica

DOI:

10.3791/2109

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20 dicembre 2010

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1University of California, San Diego

In questo articolo

Sommario

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Metodi per la preparazione di un gel iniettabile matrice dal tessuto decellularized e iniettarlo nel ratto miocardio In vivo Sono descritti.

Abstract

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Questo protocollo fornisce i metodi per la preparazione di un iniettabile matrice extracellulare (ECM) gel per applicazioni di ingegneria dei tessuti del miocardio. In breve, il tessuto decellularized è liofilizzato, macinato, digerito enzimaticamente, e poi portato a pH fisiologico. La liofilizzazione elimina tutto il contenuto di acqua dal tessuto, con conseguente ECM secco che può essere macinato in una polvere fine con un piccolo mulino. Dopo la fresatura, la polvere ECM viene digerito con pepsina per formare una matrice iniettabile. Dopo aggiustamento a pH 7,4, il materiale della matrice liquido può essere iniettato nel miocardio. Risultati dei dosaggi caratterizzazione precedenti hanno dimostrato che i gel matrice prodotta dal tessuto miocardico decellularized pericardico e conservare i componenti nativi ECM, tra cui diverse proteine, peptidi e glicosaminoglicani. Dato l'utilizzo di questo materiale per l'ingegneria tissutale, caratterizzazione in vivo è particolarmente utile, qui, un metodo per eseguire una iniezione intramurale nel ventricolo sinistro (LV) parete libera è presentato come un mezzo per analizzare la risposta dell'ospite al gel matrice un modello animale di piccole dimensioni. L'accesso alla cavità toracica si ottiene attraverso il diaframma e l'iniezione è fatta leggermente sopra l'apice nel muro LV libero. La derivazione biologica impalcatura può essere visualizzata da biotina-etichettatura prima dell'iniezione e poi colorazione sezioni di tessuto con un rafano perossidasi-coniugato neutravidin e la visualizzazione tramite diaminobenzidina (DAB) colorazione. Analisi della regione di iniezione può essere fatto anche con colorazione istologica ed immunoistochimica. In questo modo, i gel già esaminato matrice pericardio e del miocardio hanno dimostrato di forma fibrosa, reti poroso e promuovere la formazione di vasi all'interno della regione di iniezione.

Protocollo

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1. Pre-elaborazione del tessuto di preparazione

  1. Prima di utilizzare questo protocollo, si deve avere già decellularized il tessuto di scelta. Per questo esempio, suina fresca e campioni pericardio umano sono decellularized con risciacqui ipotoniche e ipertoniche in deionizzata (DI) e dodecil solfato di sodio (SDS).
  2. In particolare, prima lavare il pericardio porcino in acqua deionizzata per 30 minuti, quindi mescolare continuamente in 1% SDS a tampone fosfato (PBS) per 24 ore, seguito da un ore di acqua 5 di risciacquo. Per pericardia umana, primo risciacquo in acqua deionizzata per 30 minuti, quindi mescolare continuamente in SDS 1....

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Discussione

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Questo metodo consente la generazione di derivazione biologica, scaffold iniettabili per l'ingegneria tissutale del miocardio. Anche se questi metodi sono stati inizialmente sviluppati per la fabbricazione e la sperimentazione in vivo di un gel matrice del miocardio e presentato qui con un gel matrice pericardico, questo protocollo può essere adattato per essere utilizzato con qualsiasi tessuto, a condizione che il tessuto può essere opportunamente decellularized. Decellularization deve essere eseg.......

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Dichiarazioni

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Animale Usa: Tutti gli esperimenti in questo studio sono stati eseguiti in conformità con le linee guida pubblicate dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso la University of California, San Diego e l'Associazione Americana per l'accreditamento delle cure degli animali da laboratorio.

Ringraziamenti

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Questa ricerca è stata sostenuta in parte dal Programma New Innovator il direttore NIH Award, parte del NIH Roadmap per la ricerca medica, attraverso il numero di concedere 1-DP2-OD004309-01. SBS-N. Desideriamo ringraziare la NSF per una borsa di studio Graduate Research.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagenti:
PepsinaSigma-Aldrichp6887-1GLiofilizzato
BiotinaThermo Fisher Scientific, Inc.21217
Neutravidina-HRPThomas Scientific21130
Attrezzatura:
Wiley Mini MillThomas Scientific3383L10
Liofilizzatore LabconcoLabconco Corp.7670520
Materiali chirurgici:
BetadinePurdue Products L.P.67618-154-16
Soluzione di Ringer lattatoMWI Veterinary Supply003966
KY JellyMWI Veterinary Supply28658
Lidocaina, 2%MWI Veterinary Supply17767
Cloridrato di buprenorfinaReckitt Benckiser12496-0757-1
Unguento oftalmico artificialeFisher ScientificNC9860843
Unguento antibiotico triploFisher Scientific19082795
IsofluranoMWI Veterinary Supply60307-120-25
Otoscopio MWI Veterinary Supply008699
Valvola a tre vieMWI Veterinary Supply006245
Chirurgia con filo 3-0 VicrileMWI Veterinary SupplyJ327H
Chirurgia con filo 5-0 ProlineMWI Veterinary Supplys-1173
Ago a taglio inverso (RC)Ethicon Inc.8684G
Microemostati Fine Science Tools13013-14
Pinzette microdentateFine Science Tools11084-07
Bisturi n. 10Fine Science Tools10110-01
Forbici smussateFine Science Tools14108-09
Forbici curve affilateFine Science Tools14085-08
Pinze grandi zigrinateFine Science Tools1106-12
Tubo di aspirazione PE160BD Biosciences427430
Forbicine per tosatura MWI Veterinary Supply21608
Stapler/staples cutanee Ethicon Inc.PRR35
Materiali generici:
Piastrine agitatori
HCl 0,1 M
NaOH 1 M
PBS 10x
PBS 1x
Etilene al 70%
Siringhe da 0,1 mL
Siringa da 10 mL
Q-tips
Colla chirurgica
Telo chirurgico
Morsetti per asciugamani
Aspiratore portatile di piccole dimensioni

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Seif-Naraghi, S. B., Salvatore, M. A., Magoffin-Schup, P. J., Hu, D. P., Christman, K. L. Design and characterization of an injectable pericardial matrix gel: A potentially autologous scaffold for cardiac tissue engineering. Tissue Engineering. , (2009).
  2. Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F.

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Matrice extracellularedecellularizzazione dei tessutipolvere di ECMdigestione con pepsinagel iniettabileiniezione intramuraleanalisi istologicacolorazione immunoistochimicamarcatura con biotinainfiltrazione vascolare

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