Metodi per la preparazione di un gel iniettabile matrice dal tessuto decellularized e iniettarlo nel ratto miocardio In vivo Sono descritti.
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Articolo metodologico
Fabbricazione di derivazione biologica Materiali iniettabili per l'ingegneria tissutale miocardica
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo protocollo fornisce i metodi per la preparazione di un iniettabile matrice extracellulare (ECM) gel per applicazioni di ingegneria dei tessuti del miocardio. In breve, il tessuto decellularized è liofilizzato, macinato, digerito enzimaticamente, e poi portato a pH fisiologico. La liofilizzazione elimina tutto il contenuto di acqua dal tessuto, con conseguente ECM secco che può essere macinato in una polvere fine con un piccolo mulino. Dopo la fresatura, la polvere ECM viene digerito con pepsina per formare una matrice iniettabile. Dopo aggiustamento a pH 7,4, il materiale della matrice liquido può essere iniettato nel miocardio. Risultati dei dosaggi caratterizzazione precedenti hanno dimostrato che i gel matrice prodotta dal tessuto miocardico decellularized pericardico e conservare i componenti nativi ECM, tra cui diverse proteine, peptidi e glicosaminoglicani. Dato l'utilizzo di questo materiale per l'ingegneria tissutale, caratterizzazione in vivo è particolarmente utile, qui, un metodo per eseguire una iniezione intramurale nel ventricolo sinistro (LV) parete libera è presentato come un mezzo per analizzare la risposta dell'ospite al gel matrice un modello animale di piccole dimensioni. L'accesso alla cavità toracica si ottiene attraverso il diaframma e l'iniezione è fatta leggermente sopra l'apice nel muro LV libero. La derivazione biologica impalcatura può essere visualizzata da biotina-etichettatura prima dell'iniezione e poi colorazione sezioni di tessuto con un rafano perossidasi-coniugato neutravidin e la visualizzazione tramite diaminobenzidina (DAB) colorazione. Analisi della regione di iniezione può essere fatto anche con colorazione istologica ed immunoistochimica. In questo modo, i gel già esaminato matrice pericardio e del miocardio hanno dimostrato di forma fibrosa, reti poroso e promuovere la formazione di vasi all'interno della regione di iniezione.
Protocollo
1. Pre-elaborazione del tessuto di preparazione
- Prima di utilizzare questo protocollo, si deve avere già decellularized il tessuto di scelta. Per questo esempio, suina fresca e campioni pericardio umano sono decellularized con risciacqui ipotoniche e ipertoniche in deionizzata (DI) e dodecil solfato di sodio (SDS).
- In particolare, prima lavare il pericardio porcino in acqua deionizzata per 30 minuti, quindi mescolare continuamente in 1% SDS a tampone fosfato (PBS) per 24 ore, seguito da un ore di acqua 5 di risciacquo. Per pericardia umana, primo risciacquo in acqua deionizzata per 30 minuti, quindi mescolare continuamente in SDS 1....
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Discussione
Questo metodo consente la generazione di derivazione biologica, scaffold iniettabili per l'ingegneria tissutale del miocardio. Anche se questi metodi sono stati inizialmente sviluppati per la fabbricazione e la sperimentazione in vivo di un gel matrice del miocardio e presentato qui con un gel matrice pericardico, questo protocollo può essere adattato per essere utilizzato con qualsiasi tessuto, a condizione che il tessuto può essere opportunamente decellularized. Decellularization deve essere eseg.......
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Dichiarazioni
Animale Usa: Tutti gli esperimenti in questo studio sono stati eseguiti in conformità con le linee guida pubblicate dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso la University of California, San Diego e l'Associazione Americana per l'accreditamento delle cure degli animali da laboratorio.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata sostenuta in parte dal Programma New Innovator il direttore NIH Award, parte del NIH Roadmap per la ricerca medica, attraverso il numero di concedere 1-DP2-OD004309-01. SBS-N. Desideriamo ringraziare la NSF per una borsa di studio Graduate Research.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagenti: | |||
| Pepsina | Sigma-Aldrich | p6887-1G | Liofilizzato |
| Biotina | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 21217 | |
| Neutravidina-HRP | Thomas Scientific | 21130 | |
| Attrezzatura: | |||
| Wiley Mini Mill | Thomas Scientific | 3383L10 | |
| Liofilizzatore Labconco | Labconco Corp. | 7670520 | |
| Materiali chirurgici: | |||
| Betadine | Purdue Products L.P. | 67618-154-16 | |
| Soluzione di Ringer lattato | MWI Veterinary Supply | 003966 | |
| KY Jelly | MWI Veterinary Supply | 28658 | |
| Lidocaina, 2% | MWI Veterinary Supply | 17767 | |
| Cloridrato di buprenorfina | Reckitt Benckiser | 12496-0757-1 | |
| Unguento oftalmico artificiale | Fisher Scientific | NC9860843 | |
| Unguento antibiotico triplo | Fisher Scientific | 19082795 | |
| Isoflurano | MWI Veterinary Supply | 60307-120-25 | |
| Otoscopio | MWI Veterinary Supply | 008699 | |
| Valvola a tre vie | MWI Veterinary Supply | 006245 | |
| Chirurgia con filo 3-0 Vicrile | MWI Veterinary Supply | J327H | |
| Chirurgia con filo 5-0 Proline | MWI Veterinary Supply | s-1173 | |
| Ago a taglio inverso (RC) | Ethicon Inc. | 8684G | |
| Microemostati | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Pinzette microdentate | Fine Science Tools | 11084-07 | |
| Bisturi n. 10 | Fine Science Tools | 10110-01 | |
| Forbici smussate | Fine Science Tools | 14108-09 | |
| Forbici curve affilate | Fine Science Tools | 14085-08 | |
| Pinze grandi zigrinate | Fine Science Tools | 1106-12 | |
| Tubo di aspirazione PE160 | BD Biosciences | 427430 | |
| Forbicine per tosatura | MWI Veterinary Supply | 21608 | |
| Stapler/staples cutanee | Ethicon Inc. | PRR35 | |
| Materiali generici: | |||
| Piastrine agitatori | |||
| HCl 0,1 M | |||
| NaOH 1 M | |||
| PBS 10x | |||
| PBS 1x | |||
| Etilene al 70% | |||
| Siringhe da 0,1 mL | |||
| Siringa da 10 mL | |||
| Q-tips | |||
| Colla chirurgica | |||
| Telo chirurgico | |||
| Morsetti per asciugamani | |||
| Aspiratore portatile di piccole dimensioni |
Riferimenti
- Seif-Naraghi, S. B., Salvatore, M. A., Magoffin-Schup, P. J., Hu, D. P., Christman, K. L. Design and characterization of an injectable pericardial matrix gel: A potentially autologous scaffold for cardiac tissue engineering. Tissue Engineering. , (2009).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F.
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Ristampe e permessi
