Studio gliali eterogeneità Influenza sulla crescita cellulare Axon Utilizzando un nuovo metodo co-coltura

Sommario

In questo protocollo, abbiamo descritto un nuovo metodo per studiare l'influenza delle eterogeneità delle cellule gliali sulla crescita degli assoni con un In vitro Di co-cultura di sistema. Rat cellule corticali gliali sono state coltivate a confluenza e cocultured con altamente purificato topo neuroni dei gangli dorsali. Diversi influenza delle cellule gliali sull'adesione neuroni e la crescita degli assoni è stato confrontato direttamente nella stessa cultura. Questo metodo fornisce un nuovo modo di studiare direttamente la eterogeneità delle cellule gliali influenza sulla adesione dei neuroni e la crescita degli assoni.

Abstract

Nel sistema nervoso centrale di tutti i mammiferi, gli assoni interrotto dopo l'infortunio non sono in grado di rigenerare i propri obiettivi di originale e di recupero funzionale è molto povera ^1. Il fallimento della rigenerazione assonale è il risultato combinato di diversi fattori tra cui l'ambiente ostile di cellule gliali, inibitori delle molecole legate mielina dei neuroni e una diminuzione intrinseca capacità rigenerativa ^2. Astrociti sono il tipo più predominante delle cellule gliali nel sistema nervoso centrale e svolgono un ruolo importante nelle funzioni dell'assone in fisiologia e le condizioni di patologia ^3. Contrasto con l'omologo oligodendrociti, gli astrociti sono una popolazione cellulare eterogenea composta da diverse sottopopolazioni astrociti con morfologie diverse e l'espressione genica ^4. Il significato funzionale di questa eterogeneità, come ad esempio le loro influenze sulla crescita degli assoni, è in gran parte sconosciuto.

Per studiare le cellule gliali, in particolare la funzione di eterogeneità astrociti nel comportamento dei neuroni, abbiamo stabilito un nuovo metodo di co-colture di neuroni alta radice purificata gangli dorsali con le cellule gliali ottenuto dalla corteccia di ratto. Con questa tecnica, siamo stati in grado di confrontare direttamente l'adesione e la crescita degli assoni dei neuroni in diverse sottopopolazioni astrociti nelle stesse condizioni.

In questo rapporto, diamo il protocollo dettagliato di questo metodo per l'isolamento astrociti e la cultura, i neuroni dei gangli dorsali isolamento e la purificazione, e la co-coltura di neuroni DRG con astrociti. Questo metodo potrebbe essere esteso anche ad altre regioni del cervello per studiare cellulare o regionali specifici di interazione tra i neuroni e cellule gliali.

Protocollo

1. Glia colture cellulari

Cellule gliali possono essere coltivate provenienti da diverse regioni del sistema nervoso centrale. L'intero processo è mostrato in figura processo.

Giorno 1 cultura piastra di rivestimento e coprioggetto

1. Sterilizzati a secco tondo microscopio vetro coprioggetto in autoclave.
2. Targhetta del coprioggetto sterilizzati sterilizzato in 24 pozzetti cultura.
3. Rivestire il coprioggetto con p....

Discussione

Questo protocollo esperimento è stato progettato per raggiungere due obiettivi per studiare le cellule gliali, l'influenza di eterogeneità soprattutto astrociti sulla adesione dei neuroni e la crescita dei neuriti. Il primo obiettivo era quello di mantenere l'eterogeneità astrociti il ​​più possibile, in questo esperimento, la confluenza delle cellule gliali cultura astrociti arricchito è stato mixato cultura primaria senza alcun trattamento chimico e la propagazione digestione, che possono ulteriormente dannegg.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM (glucosio ad alta concentrazione)	Invitrogen	10313-039
Mezzo L15	Invitrogen	11415-114
FBS	Invitrogen	10437-077
Mezzo Neurobasal	Invitrogen	21103-049
poli-lisina	Sigma-Aldrich	P4832	grado per colture cellulari
NGF (2,5S)	Invitrogen	13257-019
Integratore B27	Invitrogen	17504-044
tripsina-EDTA 0,25%	Invitrogen	25200-056
FUDR	Sigma-Aldrich	F0503
anticorpo anti-neurofilamento	Abcam	ab24575