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1. Preparazione dei reagenti
- Preparare 1x buffer Dissection a 128 mM NaCl, CaCl 2 4mm, 4 mm MgCl 2, 2 mM KCl, HEPES 5 mm e 36 mm saccarosio. Il pH della soluzione a 7,2 e filtro sterilizzare.
- Preparare il fissativo con diluizione 1:1 del 16% di formaldeide e Buffer Dissection 1x.
- Preparare 1x PBT utilizzando 1x soluzione tampone fosfato (PBS) a pH di 7,2 e Triton X-100 in un rapporto 1:100.
- Preparare il 5% di albumina sierica bovina (BSA) con 0,01% Na azide in 1x PBS.
2. Preparazione per la dissezione
- Sylgard piatti vengono utilizzati per la dissezione. Preparare i piatti versando 184 Sylgard base di elastomeri di silicone e curare miscela agente in una capsula di Petri. Lasciare il composto a solidificare completamente asciutti prima dell'uso.
- Prima della dissezione, raccogliere un paio pulito # 5 pinze, un paio di forbici pulito lama dritta Vännäs, e perni.
3. Dissezione di 3 Larve ° Instar
- Raccogliere vagare 3 ° larve instar di un genotipo specifico su una piastra di Petri.
- Lavare le larve in acqua deionizzata per sbarazzarsi del cibo.
- Inserire una larva sul piatto sylgard, con l'alto lato dorsale. Perno la larva alle sue estremità anteriori e posteriori.
- Mettere una goccia di tampone Dissection 1x sulla larva appuntato. Utilizzando bene nip forbici la larva sulla linea mediana dorsale verso la fine posteriore. Utilizzando le forbici, tagliare la cuticola larvale dalla fine posteriore fino alla fine anteriore.
- Mettere una goccia di nuovo tampone Dissection 1x sul larva sezionato. Utilizzando uno spillo, scegliere un bordo laterale della cuticola vicino al centro della larva e perno la cuticola. Usando un altro pin, pin il secondo bordo laterale della cuticola, come mostrato in figura. Due pin sono usati su entrambi i lati laterali. Vedi figura sotto.
- Rimuovere con attenzione l'intestino, corpi grassi, e la trachea, lasciando solo il cervello con i due lobi ottici e gangli ventrali con i nervi segmentali allegato. Il resto della procedura è fatto sul piatto sylgard.
4. Fissazione della larva Dissected
- Incubare la larva sezionato in correzione per 30 minuti, sostituendo la correzione ogni 15 minuti.
- Dopo la fissazione, lavare la larva in 1x PBT per 30 minuti, sostituendo il buffer ogni 10 minuti. E 'importante notare che la larva deve essere sempre in un buffer.
5. La colorazione degli anticorpi della Larva Dissected
- Preparare l'anticorpo primario diluendo alla concentrazione adeguata nel 5% BSA con Na azide in 1x PBT. Concentrazioni ottimali variano per gli anticorpi diversi.
- Sostituire l'ultimo 1x PBT sciacquare con la soluzione preparata anticorpo primario e incubare in camera umida a 4 ° C durante la notte. La camera umida è costruito da rivestimento di un piatto di plastica con kim-salviette imbevute di acqua.
- Il giorno seguente, lavare la larva sezionato in 1x PBT per 30 minuti, sostituendo il buffer ogni 10 minuti.
- Preparare l'anticorpo secondario diluito alla concentrazione appropriata nel 5% BSA con Na azide in 1x PBT, e incubare la larva con la soluzione di anticorpo secondario a 25 ° C per un'ora. Avvolgere la camera umida in un foglio per impedire alla luce, come gli anticorpi secondari sono sensibili alla luce.
- Dopo l'incubazione, lavare la larva in 1x PBT per 30 minuti, sostituendo il buffer ogni 10 minuti.
6. Montaggio e visualizzazione del Larva Dissected
- Prima di montare la larva sulla diapositiva, preparare la slitta diffondendo due linee verticali di smalto nel mezzo, con uno spazio sufficiente per una copertura antiscivolo per sedersi (vedi schema). Lasciare asciugare completamente smalto.
- Mettere una goccia di tampone di montaggio nello spazio tra le linee verticali smalto per unghie sulla diapositiva (vedi schema). Il vetrino è pronto per il montaggio.
- Dopo l'ultimo risciacquo 1x PBT, rimuovere delicatamente i perni laterali. Fare attenzione a non strappare la cuticola.
- Rimuovere con attenzione i due perni rimanenti e raccogliete la larva con una pinza e la larva posto orizzontalmente sul vetrino preparato. Assicurarsi che la larva non è capovolto ed è orientato a lato ventrale.
- Delicatamente luogo uno slittamento di copertura sulla parte superiore e sigillare i bordi con smalto per unghie (vedi schema). La larva è ora pronto per la visualizzazione al microscopio a fluorescenza.
7. Rappresentante Risultati
Figura 1: Una immagine rappresentativa del larvale nervi segmentali da un tipo selvaggio larvA utilizzando anticorpi contro la proteina proteina sinaptica stringa vescicola cisteina (CSP, Zinsmaier et al. 1994). Si noti che i nervi segmentali sono uniformemente colorati. Bar = 20μm
Figura 2: Una immagine rappresentativa del larvale nervi segmentale da una larva proteina mutante motore utilizzando anticorpi contro la proteina proteina sinaptica stringa vescicola cisteina (CSP). Si noti che i nervi segmentali mostrano accumuli di massa che macchia brillante per il CSP (frecce).