Introduciamo un digiuno a base di test a fluorescenza che controlla il tasso di estinzione di fluorescenza come una misura di attività del canale gramicidina. I canali gramicidina sono utilizzati come trasduttori di forza molecolare per monitorare i cambiamenti nelle proprietà del doppio strato lipidico, come rilevato da proteine doppio strato spanning.
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Articolo metodologico
Gramicidina a base di fluorescenza di analisi, per determinare piccole molecole Potenziale Modifica delle proprietà del doppio strato lipidico
In questo articolo
Sommario
Abstract
Molti farmaci e altre molecole di piccole dimensioni utilizzato per modulare la funzione biologica sono amphiphiles che adsorbono a doppio strato / soluzione di interfaccia e di conseguenza alterano le proprietà doppio strato lipidico. Questo è importante perché le proteine di membrana sono energicamente il loro doppio strato accoppiato ad ospitare da interazioni idrofobiche. Cambiamenti nelle proprietà doppio strato così alterare la funzione delle proteine di membrana, che fornisce un modo indiretto per amphiphiles di modulare la funzione delle proteine e un possibile meccanismo di "off-target" effetti della droga. Abbiamo già sviluppato un test elettrofisiologico per rilevare i cambiamenti nelle proprietà doppio strato lipidico utilizzando canali gramicidina lineare come sonde 3,12. Canali gramicidina sono mini-proteine formata dalla dimerizzazione transbilayer di due subunità non conduttore. Essi sono sensibili ai cambiamenti nel loro ambiente membrana, che li rende potenti sonde per monitorare l'evoluzione delle proprietà doppio strato lipidico, come rilevato da proteine doppio strato spanning. Ora dimostrare un saggio a fluorescenza per la rilevazione di cambiamenti nelle proprietà doppio strato utilizzando gli stessi canali come sonde. Il test si basa sulla misurazione del tempo-corso di tempra fluorescenza da fluoroforo-caricato unilamellari vescicole grandi a causa dell'entrata di un quencher attraverso i canali gramicidina. Usiamo l'indicatore di fluorescenza / quencher paio 8-amminonaftalen-1 ,3,6-trisulfonate (ANTS) / Tl + che è stato utilizzato con successo in altri saggi di tempra fluorescenza 5,13. Tl + permea il doppio strato lipidico lentamente 8 ma passa rapidamente attraverso lo svolgimento di canali gramicidina 1,14. Il metodo è scalabile e adatto sia per studi meccanicistici e high-throughput screening di piccole molecole per doppio strato, perturbante, e le potenzialità "off-target", effetti. Troviamo che i risultati con questo metodo sono in buon accordo con precedenti risultati elettrofisiologici 12.
Protocollo
1. Genera ANTS pieno di liposomi
- Il giorno 1, rimuovere il solvente da lipidi organici.
- Togliere dal freezer lipidi e lasciarlo a temperatura ambiente.
- Aggiungere 0,6 mL di 25 mg / ml (1,2-dierucoyl-sn-glicero-3-phosphocholine) lipidi in soluzione cloroformio in un pallone basso a 25 mL.
- Continuamente ruotare il pallone mentre si asciugava sotto azoto, fino a quando tutti i cloroformio è evaporato e un sottile velo bianco di mani lipidi tutta la metà inferiore del pallone.
- A secco in un essiccatore sotto vuoto durante la notte.
- Il giorno 2, la preparazione del campione con il fluoroforo che verrà i....
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Discussione
Abbiamo dimostrato un veloce fluorescenza a base di test per determinare il potenziale di doppio strato modificando di farmaci ed altre amphiphiles di piccole dimensioni. Composti che modificano le proprietà doppio strato possono alterare la funzione delle proteine di membrana in un indiretto, maniera aspecifica, contribuendo probabilmente a "off-target" effetti della droga. Il test sfrutta la potenza dei canali gramicidina come sonde per i cambiamenti nelle proprietà doppio strato 12 che vengono .......
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Dichiarazioni
Una domanda di brevetto provvisorio che copre i metodi descritti nel manoscritto è stato depositato. Il co-inventori sono HII e OSA.
Ringraziamenti
Ringraziamo Michael J. Bruno, Radda Rusinova e Jon T. Sacco per molte discussioni stimolanti. Sostegno finanziario da NIH, R01GM021342 e ARRA supplemento R01GM021342-35S1, e Josiah Macy Jr. Foundation per OSA, il Tri-I CMB programma per HII e The L. Iris e Leverett S. Woodworth Medical Scientist Fellowship e NIH MSTP concedere GM07739 per RK.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| ANTS | Invitrogen | A-350 | |
| gramicidina | Sigma-Aldrich | G-5002 | |
| 1,2-dierucoil-sn-glicerolo-3-fosfocolina | Avanti Polar Lipid, Inc | 850398C | |
| Kit Mini-Extruder | Avanti Polar Lipid, Inc | 610000 | |
| Colonna desalinizzante PD-10 | Sigma-Aldrich | 54805 |
Riferimenti
- Andersen, O. S. Ion transport through simple membranes. Renal Function. Giebisch, G. H., Purcel, E. F. , The Josiah Macy, Jr. Foundation. New York. (1978).
- Andersen, O. S., Koeppe, R. E. Bilayer thickness and membrane protein function: An energetic perspective. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 1....
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Ristampe e permessi
