Espressione, solubilizzazione detergente, e purificazione di un trasportatore di membrana, la proteina multiresistente MexB Resistenza

Sommario

In questo protocollo dimostriamo l'espressione, solubilizzazione e la purificazione di una proteina di membrana ricombinanti espresse, MexB, come un complesso proteina solubile detergente. MexB è un trasportatore di membrana multifarmaco resistenza da parte degli agenti patogeni opportunistici batterici Pseudomonas aeruginosa.

Abstract

Multiresistenza ai farmaci (MDR), la capacità di una cellula tumorale o patogeno per resistere ad una vasta gamma di strutturalmente e funzionalmente correlati farmaci anti-cancro o antibiotici, è un grave problema attuale della salute pubblica. Questa resistenza ai farmaci è in gran parte a causa di pompe per la somministrazione di energia-dipendente efflusso. Le pompe espellere farmaci anti-cancro o antibiotici nel mezzo esterno, riducendo la loro concentrazione intracellulare di sotto di una soglia di tossicità. Stiamo studiando la resistenza ai farmaci in Pseudomonas aeruginosa, un patogeno opportunistico che provoca infezioni batteriche nei pazienti con molti tipi di lesioni o malattie, per esempio, ustioni o fibrosi cistica, e anche in immuno-cancro, dialisi, trapianto e pazienti. Le principali pompe di efflusso MDR in P. aeruginosa sono complessi tripartita composta da una membrana interna protone-droga antiporter (RND), un canale di membrana esterna (OMF), e una proteina linker periplasmatico (MFP) ^1-8. Le proteine ​​RND e OMF sono proteine ​​transmembrana. Proteine ​​transmembrana rappresentano oltre il 30% di tutte le proteine ​​e il 65% dei bersagli farmacologici in corso. I domini transmembrana idrofobici produrre le proteine ​​solubili in tampone acquoso. Prima di una proteina transmembrana può essere purificato, è necessario trovare le condizioni tampone contenente un detergente delicato che consentono la proteina di essere solubilizzati come un complesso detergente proteico (PDC) ^9-11. In questo esempio, usiamo un RND proteine, il P. aeruginosa transmembrana trasportatore MexB, per dimostrare come esprimere una forma ricombinante di una proteina transmembrana, solubilizzare usando detersivi, e poi purificare i complessi proteici detergente. Questo metodo generale può essere applicato l'espressione, la purificazione, e la solubilizzazione di molte altre proteine ​​di membrana ricombinanti espresse. I complessi proteici detergente può essere utilizzato successivamente per la caratterizzazione biochimica e biofisica tra cui X-ray determinazione della struttura cristallina o studi di reticolazione.

Protocollo

1. 1 ° giorno:

MexB da Pseudomonas aeruginosa è codificato da pFB101. Il gene è stato amplificato da MexB P. aeruginosa DNA genomico e inserite nel NdeI e siti di restrizione XhoI del + pET30b vettore. Il costrutto contiene un C-terminale tag hexahistidine.

1. Il plasmide viene utilizzato per trasformare E. coli ceppo C43 (DE3) ^12, e il trasformanti sono placcati su agar LB contenente 30 ug / ml kanamicina.

2. 2 ° giorno: Pernottamento Culture:

2. In serata, 4 X 3 culture LB ml contenente 30 ug / ml kanamicina sono inoculate dalle colonie trasformante fresca. In alternativa, le culture possono essere inoculato da una permanente congelato.
   Queste culture piccoli sono coltivate su un rullo a 37 ° C durante la notte.

3. 3 ° giorno: Growing 6 litri Culture:

3. Al mattino, utilizzare le culture durante la notte per inoculare LB 150 ml contenente 30 ug / ml kanamicina. Far crescere la coltura a 37 ° C su un agitatore.
4. Nel pomeriggio, usare la cultura piccolo per inoculare 6 x 1L 2XYT supporti contenenti 30 ug / ml kanamicina in fiaschi Fernbach. (Usa 25 mL per la cultura per una diluizione 1:40). Crescono le culture a 37 ° C fino a quando non raggiungono un diametro esterno ₆₀₀ del 0,4-0,6, circa 1,5 ore
5. Quando le culture raggiungere la giusta densità, indurre l'espressione delle proteine ​​con l'aggiunta di IPTG 1M 0,5 ml. Mettere tutti i palloni indietro nello shaker e continuano a crescere loro a 30 ° C durante la notte.

4. Giorno 4: Raccolta Cellule e Purificare la proteina:

6. Aggiungi inibitori della proteasi, DNAsi, e lisozima per le soluzioni tampone come segue: a 50 ml di tampone risospensione delle cellule, aggiungere DNaseI 10 mg (0,1 mg / ml concentrazione finale), 1 Completa EDTA senza tavoletta inibitore della proteasi, e un pizzico di lisozima . A 60 mL di tampone membrana risospensione, aggiungere 1 compressa inibitore della proteasi. Per un altro da 50 ml di tampone membrana risospensione, aggiungere 1 compressa inibitore della proteasi. Tenere tutte e tre le soluzioni in ghiaccio.
7. Centrifugare le culture 30 min 5.000 giri in su larga scala centrifuga per raccogliere le cellule.
8. Risospendere le cellule in 100 ml di tampone risospensione delle cellule (50 NaP mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, 2 mM MgCl _2, 1 Completa EDTA senza tavoletta inibitore della proteasi, 0,1 mg / ml di DNAsi I, un pizzico di lisozima)
9. Far passare la soluzione di cellule due volte attraverso una cella di pressione francese a 12.000 psi (762 pressione manometrica). Raccolgono il lisato cellulare in una bottiglia mantenuto freddo sul ghiaccio.
10. Trasferire il lisato cellulare di SS34 provette da centrifuga e centrifugare per rimuovere i detriti cellulari per 30 min a 10.000 rpm a 4 ° C in un rotore-34 SS.
11. Rimuovere con attenzione il sopranatante in Ti647.5 tubi ultracentrifuga. Centrifuga da 50 min a 40.000 rpm a 4C. Scartare il surnatante.
12. Risospendere il pellet, che contiene le membrane delle cellule, a ca. 25 mL di tampone risospensione membrana (50 NaP mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% glicerolo, 1 Completa EDTA senza tavoletta inibitore della proteasi).
13. Trasferire la sospensione membrana ad una provetta pulita e centrifugare a 40.000 rpm in un rotore Ti647.5 per 50 minuti a 4 ° C.
14. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet lavato membrana in 25 mL di tampone risospensione membrana (50 NaP mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% glicerolo, 1 Completa EDTA senza tavoletta inibitore della proteasi).

5. TM Proteine ​​Solublization:

15. Per le membrane risospeso (circa 25 ml), aggiungere 6 mL DDM 10% (concentrazione finale detergente DDM = 2%) Rock la miscela a 4 ° C per 2 ore.
16. Centrifugare la miscela a 40.000 rpm per 40 minuti a 4 ° C nel rotore Ti647.5 per separare il detergente solubile complessi proteici da proteine ​​insolubili. Salvare il surnatante, che contiene il detergente MexB complessi proteici.

6. IMAC:

17. Mescolare il surnatante ottenuto dalla rotazione ad alta velocità con le perline di metallo affinità talon equilibrata nel buffer di risospensione. Incubare per 1 ora su un rullo a 4 ° C.
18. Versare l'impasto in un corpo colonna a gravità ed eliminare il flusso attraverso.
19. Lavare la colonna con 20 ml (10 volumi di colonna) di IMAC Binding Buffer e Wash (50 NaP mM, pH 7, 300 mM NaCl, 5% glicerolo, 0,2% DDM)
20. Eluire la proteina con tampone di eluizione IMAC (50 NaP mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% glicerolo, 250 mM imidazolo, DDM 0,2%).
21. Prendere 15 campioni microlitri della frazioni di eluizione, mescolare ognuno con 15 microlitri di buffer 2X SDS campione per l'analisi mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide. Spin 30sec in una microcentrifuga. Analizzare i campioni su un 10% di poliacrilammide SDS gel per stimare la quantità e la purezza di MexB in ogni frazione.
22. In comune le frazioni contenenti i complessi proteici detergente MexB e concentrarle in un concentratore di rotazione a 4 ° C. Fare attenzione che la proteina non precipitare in questa step.

7. Gel filtrazione Colonna:

23. Pre-equilibrare uno Superose 12 HL 30/10 colonna con 24 mL di tampone di corsa (50 NaP mM, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% glicerolo, 0,2% beta-octylglucoside), e attendere una linea di base piatta.
24. Sciacquare il sistema a ciclo Akta carico con tampone di corsa.
25. Filtrare la soluzione proteica utilizzando un filtro siringa prima di applicarlo alla colonna.
26. Di carico fino a 240 microlitri della soluzione proteica sulla colonna, con una concentrazione di proteine ​​fino a 5 mg / ml.
27. Esegui 1,5 volumi di colonna (36 ml) di tampone, raccogliere frazioni 0,25 ml. I complessi proteici detergente MexB deve eluire come un picco intorno ai 10 - 15 ml di volume di eluizione.
28. Prendere 5 campioni microlitri della frazioni di picco. Mescolare ogni campione 1:1 con tampone 2X campione SDS. Analizzare i campioni su un gel di poliacrilamide al 10% per stimare la quantità e la purezza di MexB in ogni frazione
29. Pool di frazioni contenenti MexB puro.

8. Rappresentante dei risultati:

Figura 1 include un gel di poliacrilamide con le frazioni colonna raccolti dalla colonna IMAC e le frazioni singoli dalla colonna gel filtrazione. Dopo la colonna di gel filtrazione la proteina sembra puro gel di poliacrilammide Coomassie macchiati. Figura 2 include una traccia dalla colonna gel filtrazione mostra la vetta principale del complesso eluizione di detergente proteico dalla colonna. Il rendimento medio di proteine ​​MexB è di circa 2 mg per 6 litri di cultura 2XYT.

Figura 1. SDS-PAGE gel di purificazione del PDC MexB. Corsia 1, marcatori di peso molecolare. 2, pool frazioni IMAC. 3-7, gel filtrazione colonna frazioni.

Figura 2. Esempio di risultati Gel filtrazione per complessi proteici detergente MexB (PDC).

Discussione

Oltre alla resistenza multidrug, molte attività vitali cellulari, compreso il trasporto di ioni, comunicazione cellula-cellula, il trasporto delle vescicole, il mantenimento della struttura cellulare, e interazioni ospite-patogeno, coinvolgono le proteine ​​che sono incorporati nella membrana cellulare. Proteine ​​transmembrana costituiscono oltre il 30% di proteine ​​note e sono gli obiettivi per la maggior parte dei farmaci oggi in uso. Il pieghevole improprio o attività delle proteine ​​transmembrana portare a import...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tampone campione SDS	Bio-Rad	161-0737
Stirpe di E. coli C43(DE3)	Lucigen	60345-1
solfato di kanamicina	Sigma-Aldrich	K4378
terreno 2XYT	Fisher Scientific	BP2466-2
terreno LB	Fisher Scientific	AC61189-5000
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758
DNasi I	Fisher Scientific	BP3226-1
lisozima	Sigma-Aldrich	L7651
compresse di inibitore di proteasi completo senza EDTA	Roche Group	11 873 580 001
NaP monobasico	Sigma-Aldrich	S6566
NaP dibasico	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	S6191
MgCl2	Sigma-Aldrich	M1028
Glicerolo	Fisher Scientific	BP229-1
n-dodecil-β-D-maltopiranoside	Anatrace	D310
tubi da 15 ml	Corning	430052
Agitatore oscillante (See-Saw Rocker)	Fisher Scientific	SSL 4
resina per affinità su metallo Talon	Clontech Laboratories	635503
imidazolo	Sigma-Aldrich	I5513
gel SDS-PAGE al 10% di poliacrilamide	Bio-Rad	161-1454
tampone di corsa Tris/glicina/SDS-PAGE	Bio-Rad	161-0732
marcatori di peso molecolare precolorati Kaleidascope	Bio-Rad	161-0324
colonna Superose 12 30/10	GE Healthcare	12 10/300 GL
concentratore centrifugo Amicon	EMD Millipore	UFC801024
filtrino per siringa	Fisher Scientific	SLFG R04 NL
flaconi di Fernbach	Fisher Scientific	09-552-39
agitatore per flaconi di Fernbach	Fisher Scientific
sistema Akta	GE Healthcare
centrifuga su larga scala J6 con rotore JLA-8.1000	Beckman Coulter Inc.
bottiglie da centrifuga da 1 l	Beckman Coulter Inc.	969329
centrifuga RC-5	Thermo Fisher Scientific, Inc.
rotore fisso SS34 e tubi	Thermo Fisher Scientific, Inc.
ultracentrifuga da pavimento Sorvall	Thermo Fisher Scientific, Inc.
rotore T647.5 e tubi con tappi	Thermo Fisher Scientific, Inc.	08322
French Pressure Cell	Thermo Fisher Scientific, Inc.	FA-032