Tutta la tecnica di coltura degli embrioni del mouse ci permette di cultura e di embrioni di ratto Ex vivo durante i periodi limitati corrispondenti a fasi midgestation. In questo protocollo video, abbiamo dimostrato le nostre procedure standard di coltura degli embrioni di ratto dopo tutto E12.5 con il rotore di tipo sistema cultura bottiglia.
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Articolo metodologico
Il metodo di coltura degli embrioni roditori intero utilizzando il Rotator tipo di sistema cultura Bottiglia
In questo articolo
Sommario
Abstract
Intera coltura degli embrioni (WEC), la tecnica è stata sviluppata nel 1950 da New e dei suoi colleghi, e applicato per la biologia dello sviluppo 1. Anche se lo sviluppo e la crescita di embrioni di mammifero sono criticamente dipendente dal funzionamento della placenta, WEC tecnica ci permette di topo cultura e di embrioni di ratto condizione di ex-vivo durante i periodi limitati corrispondenti a fasi midgestation durante il giorno embrionale (E) 6,5 E12.5 nel mouse o E8.5-E14.5 nel ratto 2, 3, 4. In WEC, possiamo direttamente target desiderato aree di embrioni con fini di vetro capillari, perché gli embrioni possono essere manipolati al microscopio. Pertanto, WEC roditore è una tecnica molto utile quando si vogliono studiare i processi di sviluppo dinamico di postimplanted embrioni di mammifero. Fino ad oggi, diversi tipi di sistemi sono stati sviluppati WEC 1. Tra questi, il rotore di tipo sistema di coltura bottiglia è più popolare e adatto a lungo termine cultura di embrioni a midgestation, cioè dopo la E9.5 e E11.5 nel topo e ratto, rispettivamente 1. In questo protocollo video, dimostriamo il nostro procedure standard del WEC ratto dopo E12.5 utilizzando un modello raffinato del sistema originale dei rotatori, che è stato progettato per nuovi e di Cockroft 5, 6, e introdurre le varie applicazioni della tecnica WEC per gli studi di sviluppo dei mammiferi biologia.
Protocollo
1. Impostazione del sistema WEC
- Misto una membrana di 0,22 micron filtro per il tubo di silicone di ingresso all'interno del sistema WEC a).
- Aprire la valvola di una bombola di gas contenente O 2 (95%) e CO 2 (5%). Flusso della miscela di gas nel tamburo attraverso la bottiglia contenente acqua bolle autoclave.
- Regolare il volume del flusso di miscela di gas a 50 cc.
- Inserire il tubo in silicone da lasciare in una bottiglia d'acqua e controllare il flusso di miscela di gas.
- Ruotare il tamburo alla velocità di 20 giri / min.
2. Preparazione del terreno ....
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Discussione
Ci sono due passaggi critici nel WEC roditori per il successo. In primo luogo, la procedura di dissezione dovrebbe essere accurato per non danneggiare gli embrioni, soprattutto vasi sanguigni. In secondo luogo, la procedura dovrebbe essere il più rapidamente possibile, perché l'ossigeno e nutrienti non sono più forniti attraverso la placenta dopo l'isolamento dall'utero. Questo è fondamentale per i vecchi embrioni. Nel caso del WEC ratto dopo E12.5, dovremmo trasferire embrioni sezionati in bottiglie di cult.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Sig. Hajime Ichijo per la video-registrazione e consigli utili per l'editing del video. Ringraziamo anche Drs.Yuji Tsunekawa e Kaichi Yoshizaki per gentile assistente per il video-registrazione. Questo lavoro è supportato da KAKENHI su B per giovani scienziati e di priorità Aree-Molecular Brain Science da MEXT del Giappone. Riconosciamo l'appoggio di Global COE Program "Centro di ricerca di base e traslazionale per la scienza del cervello globale" da MEXT del Giappone e il Nucleo di Ricerca per la Scienza e la Tecnologia evolutiva (CREST) da Science e Technology Corporation giapponese di scienza giapponese e Technology Agency (JST) .
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Nome | Tipo | Azienda | Numero di catalogo | Commento |
| Impostazione WEC | ||||
| WEC sistema (10-0310) | Strumento | Ikemoto Rika | 010-0310 | Un altro piccolo modello è inoltre disponibile. |
| Tappo in silicone senza foro | Strumento | Ikemoto Rika | 010-032-08 | |
| Miscela di gas cilindro | Strumento | Nikko Sanso | - | Contenente 95% di ossigeno e di anidride carbonica del 5%. Ordine personalizzato. |
| Regolatore del gas | Strumento | Ono Seisakusho | WR-11 | |
| 0,22 micron filtro Millex GS | Strumento | Millipore | SLGS033SS | |
| Anestesia e isolamento dell'utero | ||||
| Forbici di grandi dimensioni | Strumento | Napox | B-7H | |
| Forcipe | Strumento | Napox | A-3-2 | |
| Piatto disposizione Petri (90 mm x 15 mm) | Strumento | Iwaki | SH90-15 | Profonda di tipo piatto è la migliore per la dissezione. |
| Isoflurano | Reagente | Abbott | B506 | Per l'anestesia |
| Di sodio pentobarbital | Reagente | Schering-Plough Animal Health | - | Per l'anestesia |
| Tyrode della salina | Reagente | - | - | Secondo il protocollo di rif. 2. Salva a 4 ° C. |
| Cronometrato in gravidanza ratto Sprague-Dawley | Animale | Fiumi Charles Laboratori Giappone | - | |
| Preparazione del terreno di coltura | ||||
| Cultura bottiglia di vetro | Strumento | Ikemoto Rika | 010-032-05 | |
| Smaltimento cultura bottiglia | Strumento | Ikemoto Rika | 010-032-06 | |
| Tappo in silicone con foro | Strumento | Ikemoto Rika | 010-032-07 | |
| Foglio di alluminio | Strumento | Ogni azienda | - | |
| Sacchetto in autoclave | Strumento | Hogy | HM-26 | Per le bottiglie di cultura |
| Sacchetto in autoclave | Strumento | Hogy | HM-14A | Per i tappi di silicone |
| 0,45 micron filtro Millex HA | Strumento | Millipore | SLHA033SS | |
| 50 ml tubo conico | Strumento | Becton Dickinson | 352070 | |
| Bicchiere da 100 ml | Strumento | Iwaki | TE-32 | |
| Rat IC siero | Reagente | Fiumi Charles Laboratori Giappone | - | Si riferiscono a: Sig. Kunihiko Morisaki, TEL: +81- (0) 45-474-9336; FAX: +81- (0) 45-474-9340 |
| D (+)-glucosio | Reagente | Wako | 041-00595 | |
| Antibiotico-antimyotic liquido | Reagente | Gibco | 15240 | |
| Dissezione di embrioni | ||||
| Forbici oftalmica dritto | Strumento | Napox | MB50-7 | Per il taglio della parete uterina |
| Forbici curve oftalmica | Strumento | Napox | MB54-2 | Per il taglio del sacco vitellino |
| Pinza # 5 | Strumento | Vigore | T6715 | |
| Pinza # 5F | Strumento | Regine | T6819 | |
| Pipetta di vetro | Strumento | - | - | Fatti a mano utilizzando pipetta Pasteur. |
| Sacchetto in autoclave | Strumento | Hogy | HM-4 | Per pipette in vetro |
| Microscopio binoculare | Strumento | Leica | Mz7s | |
| Luce | Strumento | Leica | CLS 150XD | |
| Olio di pietra | Strumento | Uchida Yoko | 833-2000 | Per l'affilatura di forcipe |
| Olio per macchine | Strumento | Uchida Yoko | 835-0000 | Per l'affilatura di forcipe |
Riferimenti
- New, D. A. T. Intoroduction. In mammalian postimplantation embryos. In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. 1-14 (1990).
- Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. In Mammalian Postimplanta....
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Ristampe e permessi
