Microscopia intravitale della microcircolazione cervello di topo usando una finestra chiusa del cranio

Sommario

Microscopia intravitale di seguire gli eventi emodinamici infiammatori e temporale e spaziale del microcircolo piale.

Abstract

Questo modello sperimentale è stato disegnato per valutare la microcircolazione piale mouse durante acute e croniche, emodinamica fisiologico e fisiopatologico, stati infiammatori e metabolici, utilizzando in vivo microscopia a fluorescenza. Una finestra chiusa del cranio è posta sopra la sinistra corteccia parieto-occipitale dei topi. Microcircolazione locale è registrato in tempo reale attraverso la finestra utilizzando epi e illuminazione a fluorescenza, e le misure di diametri navi e dei globuli rossi (RBC) velocità vengono eseguiti. RBC velocità viene misurata utilizzando in tempo reale cross-correlazione e / o eritrociti fluorescente-etichettati. L'adesione dei leucociti e delle piastrine alle navi piale e valutazione della perfusione vascolare e perdite sono realizzati con l'aiuto di marcatori di fluorescenza marcati come gli anticorpi albumina-FITC e anti-CD45-TXR. Microcircolazione possono essere ripetutamente il video-registrato per diversi giorni. Abbiamo usato per la prima volta alla chiusura microscopia cervello finestra intravitale per studiare il microcircolo piale di seguire i cambiamenti dinamici nel corso di infezione da Plasmodium berghei ANKA nei topi e mostrano che l'espressione di CM è associata a disfunzioni del microcircolo caratterizzata da vasocostrizione, marcata diminuzione nel sangue flusso e alla fine il collasso vascolare.

Protocollo

1. Craniotomia

Un craniotomia a 8-a-10-settimana topi vecchi deve essere eseguita in anticipo come descritto in precedenza ^1, tranne che una barra di titanio non si trova nella testa dell'animale. La finestra cronica cranica è un esame che consente la preparazione stabile della microcircolazione piale anche mesi dopo essere stato impiantato. Di solito, noi dobbiamo fare i nostri studi 2-3 settimane dopo l'impianto finestra cranica.

2. Microscopia intravitale

1. Due-tre settimane dopo la craniotomia, la temperatura corporea è controllata e poi il mouse è leggermente anestetizzati con isoflurano (4% per l'induzione, 1-2% per la manutenzione). Anestesia luce è utilizzato per prevenire lo stress degli animali e il disagio durante la procedura sperimentale.
2. Gli animali vengono poi poste in posizione prona su un telaio stereotassico e la testa accuratamente protetti utilizzando le barre orecchio. Il livello è regolato con le leve destra e sinistra. Temperatura corporea viene mantenuta con una piastra elettrica. Poiché i topi con malaria cerebrale sviluppano ipotermia, le impostazioni di temperatura devono essere adeguate per ogni animale.
3. Lo slittamento di copertura sulla finestra cranica è delicatamente pulito con un batuffolo di cotone imbevuto di olio minerale e una foto panoramica dei vasi sotto la finestra è presa con l'aiuto di uno stereomicroscopio e una macchina fotografica digitale (Nikon Coolpix 995, Giappone). L'immagine è stampata, identificato e datato e sarà utilizzata come una mappa per le misure del diametro del vaso e di globuli rossi (RBC) velocità.
4. Il mouse è poi trasferito in una fase microscopio intravitale (personalizzato Leica-McBain, San Diego, CA). Una goccia d'acqua è posizionato sulla finestra cranica approfittando della ben formata dal acrilico dentale, messa a fuoco viene regolata. Misurazioni sono effettuate utilizzando un 20X (LUMPFL-WIR, apertura numerica 0.6, Olympus) obiettivo immersione in acqua. Le stesse navi sono seguite in modo che i confronti diretti ai loro livelli basali è stato possibile effettuare, permettendo un maggiore statistiche robuste per le popolazioni piccolo campione. Le immagini vengono catturate con una macchina fotografica digitale a bassa velocità della luce (Hamamatsu C9300-221, in Giappone), o bassa telecamera analogica luce (Cohu 4815, San Diego, CA) collegato ad un nastro videoregistratore (JVC, Giappone), di data e ora (Video MicroImage sistemi, Boyertown, PA) e un monitor a colori (PELCO, Clovis, CA). Il nastro è correttamente identificati prima dell'inizio della registrazione, e il timestamp permette l'identificazione degli eventi documentando il periodo di tempo durante il quale sono stati ricodificato tali eventi.
5. Un primo controllo dei vasi è fatto per valutare la qualità della preparazione e se il sangue scorre in tutte le navi. Poi, la selezione dei vasi da misurare è fatto e dovrebbe includere venule e arteriole di diametri diversi (nel nostro preparati topo piale, maggior parte delle navi comprese tra 20 e 80μm) e coprono diverse posizioni all'interno della superficie esposta alla finestra. Arteriole e venule possono essere facilmente differenziate controllando la direzione del flusso di sangue nel ramificazioni della nave (se distribuisce o raccoglie il sangue). Nei nostri studi, le misure sono effettuate in 12 unità. Posizione precisa di ogni punto da misurare è annotato nel quadro della vascolarizzazione piale.
6. Per ogni spot, il diametro del vaso è misurata utilizzando un dispositivo di taglio dell'immagine (taglio immagine, Vista Elettronica, San Diego, CA) ^2. Una volta che il luogo è selezionata, l'immagine della nave è allineato in posizione verticale e l'immagine viene tosato fino agli estremi opposti sono allineati e la lettura è documentata. Questo valore può essere tradotto in micrometri da precedente calibrazione per ogni ingrandimento specifico utilizzando un reticolo micrometrico di taratura (Edmund Optics Inc., Barrington, New Jersey).
7. Ogni spot è registrato durante almeno 30 secondi per il monitoraggio degli eritrociti. Per l'inseguimento, un campione di sangue viene raccolto, ed eritrociti sono marcate con il colorante carbocyanine Dil (Molecular Probes, Carlsbad, CA) e infuso attraverso la vena della coda per ottenere un concentrazioni in vivo di circa 0.4-0.5% ^3. Negli animali infettati da Plasmodium berghei ANKA (PBA) che esprime la proteina fluorescente verde (GFP-PBA, una donazione dalla ricerca sulla malaria e di riferimento reagente Resource Center MR4, Manassas, VA; depositati da CJ Janse e AP Waters), nessuna infusione di etichetta cella è necessario. Le immagini video sono registrati a 150 fotogrammi al secondo. Questo tasso è impostato per ottenere 1-6 immagini di una cella su un fotogramma del video per la determinazione delle velocità fino a 8 mm / s. Le immagini video sono digitalizzati con un personal computer utilizzando il software Adobe Premiere 4.0 e xy dati di coordinate per ogni immagine cellulari ottenute utilizzando SigmaScan Pro 4.0 software (SPSS Chicago, IL) ^4. Posizioni delle cellule sono determinate manualmente piuttosto che da analisi d'immagine, dato che l'occhio di un osservatore addestrato ha dimostrato di dare una buona stima della posizione del centro di una cellula, cheh, in generale, corrisponde alla posizione di fluorescenza massima osservato per la maggior parte delle cellule orientamenti. Determinazioni multiple di posizione e velocità sono fatti per ogni cella e una media di ottenere velocità media dei globuli rossi.
8. Quando misure di velocità dei globuli rossi vengono eseguite in linea, il tempo di osservazione totale per ogni mouse non sia superiore a 10-15 minuti cardiodepressive minimizzare gli effetti dell'anestesia.
9. Una volta diametro del vaso e misure della velocità di RBC sono disponibili, il calcolo del flusso sanguigno in ogni nave può essere fatto utilizzando la formula: Q = V x π (D / ²⁾ 2, dove Q = flusso di sangue, V = velocità dei globuli rossi e D = diametro del vaso.
10. Queste procedure possono essere ripetute nel tempo. Per esempio, nel modello murino della malaria cerebrale, eseguiamo misurazioni giornaliere a partire dal giorno 4 di infezione. I valori ottenuti ogni giorno per ogni mouse sono normalizzati rispetto al giorno 0 (pre-infezione), che è considerato al 100%.
11. Oltre al diametro del vaso e le misurazioni del flusso sanguigno, le valutazioni aggiuntive possono essere eseguite, per esempio una migliore valutazione della perfusione e l'analisi di rotolamento dei leucociti e / o piastrine e l'aderenza in vasi piale. Queste misurazioni sono effettuate con l'ausilio di marcatori fluorescenti-etichettati. Nel caso della malaria, si può anche rilevare in circolazione o parassiti aderenti mediante utilizzando il ceppo PBA che esprime GFP.
12. Per la valutazione della perfusione usiamo una soluzione di albumina marcato con FITC (Sigma, St Louis, MO 50μg/mouse), e per quantificare l'adesione dei leucociti alle navi piale si usa anticorpi contro il pan-leucociti marcatore CD45 marcati con Texas Red (TXR) ( Invitrogen, Carlsbad, CA 4μg/mouse). Per questo, 25μL del Albumina-FITC (2mg/ml) e 20μL del movimento anti-CD45-PE anticorpi (200μg/mL) sono miscelati e iniettati nel pre-riscaldato vena della coda. Il mouse può essere ripreso immediatamente, se le misure di dispersione si albumina-FITC è consentito di circolare per 15 minuti. Fluorescenza verde (518nm) emessa da albumina-FITC e GFP (PBA-GFP pRBC) viene catturata usando e ALPHA Vivid: XF100-2 (Omega Optical, Brattleboro, VT), e anti-CD45-TXR fluorescenza (615nm) viene chiuso e catturato con un Vivid standard: XF42.
13. La fluorescenza marcata albumina permette una migliore visualizzazione della rete vascolare, comprese le navi penetrante, ed è particolarmente utile negli stati di malattia come la malaria cerebrale per verificare per le navi non perfuso o sotto-perfusi. Può anche essere utilizzato per misurare la perdita vascolare ^5.
14. Il fluorescente marcato anticorpi anti-CD45 lo rendono facile da identificare e quantificare rotolamento dei leucociti e l'adesione alle navi piale. Per evitare distorsioni nella quantificazione, si quantificare rotolamento e adesione sugli stessi punti predefiniti per misurare il flusso sanguigno. Quantificazione di adesione dei leucociti è fatto contando il numero di leucociti in una nave-100μm lunghezza. Rotolamento è quantificato contando il numero di leucociti viaggia a una velocità notevolmente più lento di velocità del sangue nella stessa lunghezza 100μm, per 30 secondi.

3. Rappresentante risultati

Figura 1. (Punto 2.6) Immagini della rete piale vascolare del mouse accessibile attraverso la finestra del cranio.

Figura 2. (Piazza di 3,1-3,5) visualizzare schematica del set up per la microscopia intravitale del microcircolo del mouse piale. 1: intravitale microscopio; 2: 20X obiettivo immersione in acqua; 3: sorgente di luce; 4a: digitale di scarsa illuminazione telecamera ad alta velocità; 4b: telecamera analogica; 5: il mouse nel frame stereotassico; 6: monitor del computer; 7: analogico tosatore Monitor che mostra come la tosatura immagine (freccia) viene fatto per misurare diametro del vaso.

Figura 3. (Passo 3,6-3,8) microvascolari rosso sangue velocità misurazioni delle cellule tenendo traccia delle cellule di registrazioni video ad alta velocità fluorescenza. Foto da A a F sono immagini sequenza di una nave piale, mostrando un singolo RBC in movimento che attraversano il campo microscopico delimitata dalla fotocamera. Determinazione manuale del fotogramma per fotogramma posizioni di 15 o più celle che attraversano il campo, con la sua distanza pre-calibrato, permette il calcolo della velocità media dei globuli rossi in ogni nave con l'aiuto di un foglio di calcolo Excel.

Figura 4. (Punto 3.9) dei dati di un esperimento rappresentativo che mostra i cambiamenti del flusso sanguigno piale nel tempo in Plasmodium berghei ANKA (PBA) topi infettati (n = 5) e in topi di controllo non infetto (n = 5). Mentre in topi di controllo del flusso di sangue piale è relativamente stabile nel tempo, PBA topi infettati mostrano una marcata diminuzione del flusso sanguignoal momento dello sviluppo della malaria cerebrale (giorno 6). I dati sono la media ± SEM.

Figura 5. (Step 4.3) Un gran numero di leucociti aderenti alle navi piale di un topo infettati da Plasmodium berghei ANKA, come rivelato dalla colorazione con anticorpi anti-CD45-Texas Red anticorpi fluorescenti.

Discussione

Il metodo di microscopia intravitale qui descritto fornisce uno strumento unico e potente per l'osservazione dettagliata del microcircolo piale nel topo. Permette individuando singole arteriole e venule e misurare i cambiamenti di un certo numero di parametri quali diametro nave, velocità dei globuli rossi, il flusso di sangue, aderenza e rotolamento dei leucociti, piastrine e altri elementi del sangue, fuoriuscita vascolare, pH tessutale e pO2 e potenzialmente molti altri applicazioni. La risposta vascolare in ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Isoflurano	Baxter Internationl Inc.	FDG9623
Colorante carbocianina Dil	Molecular Probes, Life Technologies	D306
Albumina-FITC	Sigma-Aldrich	A9771
Anticorpo Anti-CD45-TxR	Invitrogen	MCD4517
P. berghei ANKA-GFP	MR4	MRA-865