In questo video ci dimostra come isolare le cellule staminali della retina dalla epitelio ciliare dell'occhio del mouse e farle crescere in coltura per formare clonale sfere della retina. Le sfere che sono isolati possiedono le caratteristiche cardine delle cellule staminali: l'auto-rinnovamento e multipotenzialità.
Articolo metodologico
Isolamento di cellule staminali della retina dalla Eye mouse
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il topo adulto cellule staminali della retina (RSC) è una rara cellula quiescente trovati all'interno dell'epitelio ciliare (CE) dell'occhio dei mammiferi 1,2,3. La marcatura CE è costituito da strati interni e pigmentate non pigmentate cellula esterna, e le colonie clonale RSC che nascono da una singola cellula pigmentata dalla CE sono costituiti da due cellule pigmentate e non pigmentate, che possono essere differenziati per formare tutte le tipi di cellule della retina neurale e la RPE. Vi è una certa polemica sul fatto che tutte le cellule all'interno delle sfere contengono tutti almeno alcuni pigmenti 4; ma le cellule sono ancora in grado di formare i diversi tipi di cellule trovati all'interno della retina neurale 1-3. In alcune specie, come gli anfibi e pesci, i loro occhi sono in grado di rigenerazione dopo una lesione 5, tuttavia, l'occhio dei mammiferi non mostra tali proprietà rigenerative. Cerchiamo di identificare le cellule staminali in vivo e per capire i meccanismi che mantengono le cellule staminali della retina dei mammiferi quiescente 6-8, anche dopo l'infortunio così come servirsi di esse come una potenziale fonte di cellule per riparare i modelli fisici o genetici di lesioni agli occhi attraverso il trapianto di 9-12. Qui si descrive come isolare le cellule ciliari epiteliali dall'occhio del mouse e farle crescere in coltura in modo da formare la retina sfere clonale di cellule staminali. Poiché non ci sono marcatori conosciuti delle cellule staminali in vivo, queste sfere sono l'unico modo conosciuto per identificare in modo prospettico la popolazione di cellule staminali all'interno del epitelio ciliare dell'occhio.
Protocollo
1. Preparare le soluzioni Dissecting e soluzioni enzimatiche
- Rendere il Artificiale fluido cerebro-spinale (ACSF) e il siero senza supporti in anticipo e conservare in frigorifero.
- Pesare l'acido Kynurenic (0,2 mg / ml) e scioglierlo in 10 ml di Hilo ACSF a 37 ° C a bagno-maria in anticipo dal momento che non si dissolvono rapidamente.
- Pesare la tripsina (1,33 mg / mL) e ialuronidasi (0,67 mg / mL) e posto in un tubo di 15 ml e la tiene a -20 ° C fino al momento dell'uso. Aggiungere la soluzione di acido Kynurenic a questo tubo e filtro con un filtro di 22 micron siringa immediatamente prima dell'uso.
- Pesare inibitore della tripsina (Ovamucoid: 1 mg / mL) e si dissolvono in caldo senza siero Media e filtrare con filtro 22μm siringa.
- Fare dei mass media placcatura: Siero senza supporti contenenti FGF2 (10 ng / ml) ed eparina (2 mg / mL).
2. Isolare cellule staminali della retina dalla Eye mouse
- Isolamento delle cellule staminali della retina viene eseguita in un locale specifico sterile dedicata agli esperimenti coltura principale. Prima di iniziare questa procedura, impostare il microscopio da dissezione e la luce fredda di origine e quindi tracciare gli strumenti sterili dissezione. Ogni cappa è uno sterilizzatore a caldo tallone per la sterilizzazione degli strumenti tra i passaggi.
- Noi isolare le cellule staminali della retina da occhi che sono stati posti immediatamente in una piastra di Petri sterile contenente artificiale fluido cerebro-spinale (ACSF) dopo la loro rimozione dai topi sacrificati in base a protocolli animali approvati etica.
- Sotto il microscopio da dissezione, pulire l'occhio con le pinze: liberarsi dei capelli e il tessuto connettivo che è attaccato alla cornea / confine sclerale. Poi il trasferimento l'occhio ad un nuovo piatto con ACSF.
- Mentre dolcemente tenendo gli occhi fissi con una pinza dentata, utilizzare angolato micro-dissezione forbici per rimuovere i muscoli oculari. Togliere il nervo ottico anche se è ancora attaccato l'occhio. Cercate di non schiacciare l'occhio durante questo processo. Trasferire gli occhi ad un nuovo piatto con ACSF.
- Uso successivo curve micro-dissezione forbici per tagliare l'occhio a metà: cominciare dal nervo ottico e tagliare il centro della cornea, riuniti di nuovo al nervo ottico, dove è stato avviato il taglio. È l'ideale se i due pezzi di occhi sono più o meno equivalente di dimensioni perché questo farà il prossimo passo più facile.
- Tenendo le cornee con due pinze, buccia delicatamente l'occhio due metà a parte. Rimuovere ed eliminare l'obiettivo, viscere, e la retina neurale dai gusci degli occhi. Trasferire i gusci di un nuovo piatto con ACSF.
- Ora siamo pronti a isolare l'epitelio ciliare. Per iniziare, orientare la conchiglia oculare in modo che la cornea è sulla destra e l'epitelio pigmentato retinico (RPE) si trova sulla sinistra. Delicatamente il guscio pin occhio verso il basso con pinze dritto sul lato RPE.
- Quindi, usare un bisturi per tagliare la cornea e iride lontano dal epitelio ciliare dell'occhio spingendo delicatamente verso il basso il bisturi e non con movimenti di taglio.
- Dopo di che, tagliare l'epitelio ciliare lontano dal RPE. Usa non seghettato pinze per trasferire la striscia di epitelio ciliare ad un nuovo 35-mm piatto contenente ACSF.
- Allo stesso modo, isolare l'epitelio ciliare dal guscio altro occhio.
- Una volta che entrambe le strisce ciglia epiteliali sono stati raccolti, trasferire le strisce in un piatto da 35 mm contenente 2 ml di dispasi. Posizionare il piatto con le strisce in un incubatore a 37 ° C per 10 minuti.
- Dopo 10 minuti, trasferire le strisce dal dispasi in un piatto contenente 2 ml di tripsina filtrata, ialuronidasi, e Acido Kynurenic. Porre la capsula a 37 ° C per 10 minuti.
- Ora ritorno al microscopio da dissezione. Mentre si tiene la sclera giù con pinza dritta, utilizzare il fondo della curva non seghettato pinze per raschiare delicatamente l'epitelio ciliare lontano dalla sclera.
- Rimuovere la sclera dal piatto. Tutto ciò che dovrebbe essere lasciato nel piatto ora sono le cellule di interesse e la soluzione enzimatica.
- Utilizzando un incendio lucidato cotone collegato pipetta, trasferire questa soluzione in un tubo di 14 ml. Triturare questa soluzione 30 volte di spezzare le cellule epiteliali delicatamente forzando la soluzione dentro e fuori della pipetta.
- Centrifugare la provetta per 5 minuti a 1500 giri. Quando la centrifugazione è fatto, togliere il tubo dalla centrifuga con attenzione in quanto le cellule sono inclini a staccarsi dal fondo della provetta in questa fase.
- Aspirare delicatamente la maggior parte delle surnatante utilizzando un incendio lucidato pipetta, e si aggiunge 1 ml di inibitore della tripsina nel siero senza supporti alle cellule. Utilizzare un piccolo pozzo di cotone collegato pipetta per triturare il campione di circa 50 volte fino a quando si tratta di una cella singola sospensione.
- Centrifugare la provetta per 5 minuti a 1500 RPM.
- Rimuovere il surnatante e sostituirlo con 1 ml di vostro mezzo di placcatura. Triturare delicatamente con un incendio lucidato pipetta di vetro per risospendere le cellule.
- Dopo che il conteggioING l', le cellule piastra loro alla densità desiderata in un 24-pozzetti. Noi di solito tavola 10 cellule / mL, compilando tutti i pozzetti prima media e quindi aggiungendo la sospensione cellulare per ottenere un volume finale di 500 l di media.
- Posizionare la piastra a 37 ° C CO 2 incubatore dove non verrà spostato fino a contare le sfere che si presentano dopo 7 giorni.
3. Risultati di isolamento di cellule staminali della retina
- Quando questa procedura viene eseguita con successo, il sezionato cellule epiteliali ciliare dovrebbe essere simile a questo dopo essere stato dissociato e placcato a bassa densità (Figura 1).
- Dopo 7 giorni di cultura, la retina sfere di cellule staminali che si presentano sono contati. Una sfera dovrebbe essere superiore a 75 micron di diametro e fluttuante per essere contato come una cellula staminale sfera derivati. (Figura 2). Tuttavia, alcune cellule avranno limitato sferoidi proliferazione e la forma che non soddisfano i criteri dimensioni e non verranno conteggiati come sfere di cellule staminali derivate; un esempio di uno sferoide è mostrato qui (Figura 2).
4. Rappresentante Risultati
Figura 1.
Figura 2.
Discussione
Questo protocollo descrive come isolare le cellule staminali della retina dalla epitelio ciliare del mouse occhio 1-3. La metodologia per isolare le strisce di epitelio ciliare può variare, tuttavia gli enzimi e la metodologia per il raggiungimento di una singola cella di sospensione sono stati ottimizzati in questo protocollo. E 'anche importante che le strisce di epitelio ciliare che sono stati isolati non contengono grandi quantità di RPE o di cornea da quando questi sembrano avere un impatto negativo sul numero totale delle sfere che possono essere isolate da ogni occhio. Inoltre, il siero senza mezzi di comunicazione che facciamo che è stato originariamente formulato per il cervello neurosfere 13, è l'ideale per la coltivazione di cellule staminali della retina sfere. Si dovrebbe anche fare in modo che le cellule non sono disturbati dopo che sono stati placcati e posti nell'incubatrice in modo che le sfere in crescita non aggregato insieme 14.
Una volta che le cellule staminali della retina hanno formato sfere clonale, possono essere calcolate per ottenere un numero potenziale di cellule staminali per occhio. Le sfere allora può quindi essere dissociato in cellule singole e diversi passaggi per accertare le capacità di auto-rinnovamento o differenziate in diversi tipi di cellule della retina neurale e RPE utilizzando diverse combinazioni di fattori di crescita e / o proteine.
Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Ringraziamo Laura Clarke per la sua preziosa assistenza. Questo lavoro è supportato da NCE: Rete delle cellule staminali, CIHR e NIH.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microscopio Stemi 2000 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Sorgente luminosa a luce fredda | Carl Zeiss, Inc. | KL1500 | luce ottica a doppio braccio |
| Forbici Vannas mini curve | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Forbici Vannas angolate | Fine Science Tools | 15005-08 | |
| Pinzette #7 Dumont | Fine Science Tools | 11272-30 | non seghettate |
| Pinzette #5 Dumont | Fine Science Tools | 11251-10 | dritte |
| Pinzette fini | Fine Science Tools | 11051-10 | curve seghettate |
| Manico per bisturi #3 | Almedic | 2586-M36-10 | |
| Lame per bisturi #10 | Almedic | 2580-M90-10 | |
| Sterilizzatore a perle calde | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Dispasi | VWR international | CACB354235 | |
| Tripsina | Sigma-Aldrich | T1005 | |
| Ialuronidasi | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Acido chinurenic | Sigma-Aldrich | K3375 | 1000 IU |
| Inibitore della tripsina | Roche Group | 10109878001 | |
| Piastre da 35 mm | VWR international | CA354235 | |
| Piastra a 24 pozzetti | VWR international | CA73521-004 | |
| Pipette con tappo di cotone | VWR international | 14672-400 | arrotondate a fiamma |
| Tubi da 14 mL | Falcon BD | 352057 | Polistirene |
| Mezzo senza siero | Ref# 13 per la formulazione | ||
| FGF2 | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Eparina | Sigma-Aldrich | H3149 | 100 IU |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
