Gene consegna di cervello di ratto post-natale da parte di non-ventricolare iniezione plasmidi e Elettroporazione

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo non-virale di consegna di costrutti genetici per una certa area del cervello dei roditori viventi. Il metodo consiste di preparazione plasmide, fabbricazione micropipetta, chirurgia neonatale dei cuccioli di ratto, microiniezione del costrutto, e In vivo Elettroporazione.

Abstract

Creazione di animali transgenici è un approccio standard per studiare le funzioni di un gene di interesse in vivo. Tuttavia, molti knockout o animali transgenici non sono sostenibili a quei casi in cui viene espresso il gene modificato o cancellato in tutto l'organismo. Inoltre, una varietà di meccanismi di compenso spesso rendono difficile l'interpretazione dei risultati. Gli effetti di compensazione può essere alleviato con tempismo sia l'espressione genica o limitando la quantità di cellule transfettate.

Il metodo di postnatale non-ventricolare microiniezione e elettroporazione in vivo permette somministrazione mirata di geni, molecole di colorante siRNA o direttamente a una piccola regione di interesse nel cervello dei roditori neonato. In contrasto con tecnica convenzionale iniezione ventricolare, questo metodo permette di trasfezione di non-migratori tipi di cellule. Animali trasfettate mediante il metodo descritto qui può essere utilizzato, ad esempio, per i due fotoni imaging in vivo o in esperimenti elettrofisiologici su sezioni di cervello acuto.

Protocollo

1. Introduzione

Creazione di animali transgenici è un potente metodo di indagine delle funzioni dei geni in animali vivi ¹ e per il meccanismo di svelare la malattia ^2,3 così come per manipolare le proprietà delle cellule ^4. Tuttavia, la procedura è piuttosto laboriosa, estremamente lunga e costosa, così da giustificare l'uso di metodi alternativi consegna del gene virale come l'iniezione ^5, iniezione ventricolare neonatale con elettroporazione ⁶ e in utero elettroporazione ^7,8. Il metodo di postnatale non-ventricolare di iniezione ed elettroporazione è un insieme un....

Discussione

Metodi di consegna del gene nel cervello dei roditori viventi sono ben stabiliti per elettroporazione in utero ^7,8,11,12 e, più recentemente, per l'elettroporazione postnatale ^6. Tuttavia, questi metodi si basano su iniezione intraventricolare del DNA plasmide, che può essere limitante per diverse applicazioni. Per esempio, questi metodi non consentono targeting cellule in alcune aree cerebrali quali l'ippocampo, né la transfezione di questi non-migratori tipi di cellule come astro.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pinzetta 2A-sa, 115 mm	attrezzatura	XYtronic	XY-2A-SA	Trattare con etanolo al 70% per la disinfezione prima dell'uso in manipolazioni chirurgiche
Controllore di temperatura biologico con piastra riscaldante in acciaio inossidabile	attrezzatura	Supertech	TMP-5b
Tubo in borosilicato con filamento	materiale	Sutter Instrument Co.	BF120-69-10	Ago di vetro
Trapani monouso	materiale	Meisinger	HP 310 104 001 001 008
Dulbecco’s PBS 10X	reattivo	Sigma-Aldrich	D1408
Pinzette Dumont #5, 110 mm	attrezzatura	Fine Science Tools	91150-20	Trattare con etanolo al 70% per la disinfezione prima dell'uso in manipolazioni chirurgiche
Ealing micr–elettrodo puller	attrezzatura	Ealing	50-2013	Estrattore verticale di elettrodi in vetro
Ethilon poliammide monofilamento 6-0 FS-3 16 mm 3/8c	materiale	Johnson && Johnson	EH7177H	Fili chirurgici
Siringa micro 10,0 ml Exmire	attrezzatura	Exmire	MS*GLLX00	Siringa ermetica ai gas
Verde Fast	reattivo	Sigma-Aldrich	F7252
Elettrodi a pinza	attrezzatura	BEX	LF650P3	Trattare con etanolo al 70% per la disinfezione prima dell'uso
Controllo del trapano Foredom	attrezzatura	Foredom	FM3545	Alimentazione elettrica e controllo del trapano chirurgico. L'analogo attualmente disponibile è il kit micromotore K.1070 (Foredom)
manopola del micro-motore Foredom	attrezzatura	Foredom	MH-145	Il kit micromotore attualmente disponibile è l'analogico K.1070 (Foredom)
Piattaforma per anestesia gassosa nei topi	attrezzatura	Stoelting Co.	50264	Assemblato sull'apparecchio stereotassico
Isoflurano	reattivo	Baxter Internationl Inc.	FDG9623
Pinzette per medicazione microchirurgica, 105 mm	attrezzatura	Aesculap	BD302R	Trattare con etanolo al 70% per la disinfezione prima dell'uso in manipolazioni chirurgiche
Microfil	materiale	World Precision Instruments, Inc.	MF34G-5	Capillari per il riempimento di siringhe micro
Olio minerale	reattivo	Sigma-Aldrich	M8410
Siringa NanoFil da 10 microlitri	attrezzatura	World Precision Instruments, Inc.	NANOFIL	siringa di Hamilton
plasmide CAG-EGFP	reattivo			Estratto e purificato con il kit EndoFree Plasmid Maxi Kit (Qiagen) e disciolto in acqua priva di nucleasi alla concentrazione di 1,5 mg/ml
Generatore di impulsi CUY21Vivo-SQ	attrezzatura	BEX	CUY21Vivo-SQ
gel per elettrodi Schiller	reattivo	Schiller AG	2.158000	Gel conduttivo
Strumento stereotassico per piccoli animali	attrezzatura	David Kopf Instruments	900
St–adattatore per topo e ratto neonato	attrezzatura	Stoelting Co.	51625	Assemblato sullo strumento stereotassico. Trattare i coni auricolari con etanolo al 70% per la disinfezione prima dell'uso nelle manipolazioni chirurgiche
Forbici da studente per iride, dritte 11,5 cm	attrezzatura	Fine Science Tools	91460-11	Trattare con etanolo al 70% per la disinfezione prima dell'uso in manipolazioni chirurgiche
Tamponi assorbenti Sugi 17 x 8 mm	materiale	Kettenbach	31602	Tampone chirurgico
Pompa microsiringa UMP3 e controller della pompa microsiringa Micro 4	attrezzatura	World Precision Instruments, Inc.	UMP3-1	Microiniettore e controllore
Unità di Anestesia Univentor 400	attrezzatura	Univentor	8323001