Utilizzando un spettralmente risolta a due fotoni sistema di imaging microscopia, a livello di pixel mappe di Förster Resonance Energy Transfer (FRET) efficienze sono ottenute per le cellule che esprimono recettori di membrana ipotizzato per formare omo-oligomeriche complessi. Dal FRET mappe efficienza, siamo in grado di stimare le informazioni stechiometrico sui complessi oligomeri in fase di studio.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Quantificazione in vivo di G interazioni proteina recettore accoppiato con spettralmente risolte microscopia a due fotoni
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo studio delle interazioni delle proteine nelle cellule viventi è una zona importante della ricerca perché le informazioni accumulate entrambe le applicazioni industriali vantaggi così come gli aumenti di base conoscenze di base biologica. Förster (fluorescenza) Resonance Energy Transfer (FRET) tra una molecola donatore in uno stato elettronicamente eccitato e una molecola accettore vicino è stato spesso utilizzato per lo studio di interazioni proteina-proteina nelle cellule viventi. Le proteine di interesse sono contrassegnati da due diversi tipi di sonde fluorescenti ed espressi in cellule biologiche. Le sonde fluorescenti vengono eccitati, in genere utilizzando la luce laser, e le proprietà spettrali delle emissioni di fluorescenza provenienti dalle sonde fluorescenti vengono raccolti e analizzati. Le informazioni relative al grado di interazioni proteina è incorporato nei dati di emissione spettrale. Tipicamente, la cellula deve essere analizzato un certo numero di volte in modo da accumulare abbastanza informazioni spettrali di quantificare con esattezza la portata delle interazioni proteina per ogni regione di interesse all'interno della cellula. Tuttavia, la composizione molecolare di queste regioni può cambiare durante il corso del processo di acquisizione, limitando la determinazione spaziale dei valori quantitativi di apparente efficienza FRET ad una media di cellule intere. Per mezzo di un spettralmente risolta microscopio a due fotoni, siamo in grado di ottenere un set completo di immagini spettralmente risolta solo dopo una scansione completa eccitazione del campione di interesse. Da questi dati spettrali a livello di pixel, una mappa di FRET efficienza per tutta la cella è calcolato. Applicando una semplice teoria di FRET in complessi oligomeriche alla distribuzione sperimentalmente ottenuto di FRET efficienza in tutta la cellula, una singola scansione spettralmente risolta rivela informazioni stechiometrico e strutturali per il complesso oligomeri in fase di studio. Qui si descrive la procedura di preparazione di cellule biologiche (il lievito Saccharomyces cerevisiae) che esprimono recettori di membrana (sterile 2 recettori α-factor) taggati con due diversi tipi di sonde fluorescenti. Inoltre, illustrare i fattori critici coinvolti nella raccolta di dati utilizzando la fluorescenza spettralmente risolta a due fotoni sistema di imaging microscopia. L'utilizzo di questo protocollo può essere estesa allo studio di qualsiasi tipo di proteina che può essere espresso in una cellula vivente con un marcatore fluorescente collegato ad esso.
Protocollo
1. Progettazione plasmide
Le proteine di interesse sono fuse in una delle due etichette diverse fluorescenti, come descritto di seguito. Le etichette fluorescenti non solo forniscono informazioni sulla posizione delle proteine all'interno della cellula, ma anche informazioni quantitative in materia di omo-oligomerizzazione della proteina 1. La tecnica della fluorescenza Resonance Energy Transfer (FRET) 2-4 viene usato per raccogliere le informazioni sulle interazioni proteina 5-10. FRET utilizza il principio che un trasferimento di energia può avvenire da una molecola otticamente eccitati (generalmente i....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
In questa presentazione, abbiamo illustrato come determinare le dimensioni e informazioni strutturali su un complesso proteico oligomeri in vivo. Mentre i dati presentati è stato ottenuto da un recettore di membrana specifico (cioè Ste2p) espressa in cellule di lievito, il metodo è onnicomprensivo, nel senso che può essere applicata a qualsiasi tipo di proteina espressa in qualsiasi tipo di cellula, la unica condizione è che le proteine sono contrassegnati con i marcatori fluorescenti appropriato. Future modifi.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal UW-Milwaukee Research Initiative crescita, l'Istituto Wisconsin e tecnologie biomediche per la salute e la Fondazione Bradley.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420 | |
| Estratto di lievito | Fisher Scientific | BP1422 | |
| Polietilene glicole 4000 | Hampton Research | HR2-605 | |
| Base di azoto per lieviti senza (NH4)2SO4 e aminoacidi | Fisher Scientific | DF0335-15-9 | |
| Integratori sintetici per mezzo di coltura privo di specifici nutrienti per lieviti | Sigma-Aldrich | Y2001 | |
| D-Glucosio | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Agar | Fisher Scientific | S70210 | |
| Solfato di ammonio | Fisher Scientific | A702-500 | |
| Cloruro di potassio | Acros Organics | 424090010 | |
| Leucina | Fisher Scientific | BP385 | |
| Histidina | Fisher Scientific | BP382 | |
| Obiettivo a immersione in olio 100x corretto all'infinito Plan Achromat NA=1.43 | Nikon Instruments | ||
| Microscopio a due fotoni con risoluzione spettrale |
Riferimenti
- Raicu, V. Nanoscopy and Multidimensional Optical Fluorescence Microscopy. Diaspro, A. , CRC Press. Boca Raton. (2010).
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. New York. (2006).
- Raicu, V., Popescu, A.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
