Molte infezioni provocano una forte risposta CTL, ma a volte, la quantità di cellule rispondono non è correlata al controllo del patogeno 1. Una misura della qualità CTL è la loro capacità di uccidere specificamente 2. Etichettatura CFSE di cellule bersaglio può essere utilizzato per indagare questa qualità CTL risposta In vivo 3,4.
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Articolo metodologico
Antigene specifico In Vivo Analisi Uccidere utilizzando cellule bersaglio CFSE etichetta
In questo articolo
Sommario
Abstract
Carboxyfluorescein diacetato succinimidile estere (CFSE) può essere utilizzato per etichettare facilmente e rapidamente una popolazione di cellule per un esame più vivo. L'etichettatura è stata classicamente utilizzato per studiare la proliferazione e la migrazione. Nel metodo presentato qui, abbiamo accorciato la timeline dopo il trasferimento adottivo di guardare la sopravvivenza e l'uccisione di epitopo specifiche cellule bersaglio CFSE etichettato 4-6. Il livello di uccidere specifiche di una T CD8 + clone di cellule in grado di indicare la qualità della risposta, in quanto la loro quantità può essere fuorviante. Specifiche cellule T CD8 + può diventare funzionale esaurito nel tempo con un calo della produzione di citochine e uccidendo 7,8. Inoltre, alcuni cloni di cellule CD8 + T non può uccidere così come gli altri con diverse specificità TCR 9. Efficace per l'immunità cellulo-mediata (CMI), devono essere identificati antigeni che producono non solo un numero adeguato di risposta delle cellule T, ma anche funzionale, robusto cellule T risponde. Qui valutare l'uccisione delle cellule specifiche per cento dei due cloni T peptide specifico delle cellule in topi BALB / c.
Protocollo
1. Suscitando CTL effettori target specifici di Immunizzazione (giorno 0)
- Prima di iniziare, decidere un effettore specifico: sistema di destinazione. In questo esempio di un classico test in vivo CTL, useremo una immunizzazione peptide purificato per suscitare specifiche cellule T CD8 +. Il peptide stesso sarà utilizzato per impulso delle cellule bersaglio singenici, creando un effettore specifico: sistema di destinazione. In alternativa, si può scegliere di utilizzare patogeno intero o proteine per ottenere il effettori e gli obiettivi specifici.
- Decontaminare il piano di lavoro all'interno di una cappa di biosicurezza per garantire ....
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Discussione
Questo test può essere modificato per indagare la capacità proliferativa delle cellule, tra cui l'espansione clonale, perché CFSE divide equamente tra progenie relativamente 10,11. E 'anche possibile utilizzare l'etichettatura CFSE per studiare la migrazione delle cellule 6,12, anche se ci sono altre cellule tracciamento metodi che possono essere più appropriato a seconda delle ipotesi, per esempio tetrameri e bioluminescenza 13, che può anche essere combinato con l'etich.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati. Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso (IACUC) presso l'Università del Wisconsin-Madison.
Ringraziamenti
Vorrei ringraziare Bianca Mothe, Carla Oseroff, e Marie-France DelGuercio per avermi fatto conoscere saggi immunologici e gestione del mouse. Il lavoro nel laboratorio di GA Splitter è finanziato dal NIH concedere 1-RO1-AI-073558, GLRCE concedere 1-U54-AI-057153, e BARD USA-3829-06.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| perle di vetro da 1 mm | Biospec Products | 11079110 | |
| 70 μfiltro per cellule m | BD Biosciences | 352350 | |
| piatto a 96 pozzetti | Costar | 3799 | |
| Adiuvante di Freund incompleto’s Adiuvante | Pacific Immunology | n/d | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| FBS | GIBCO, di Life Technologies | 16000-077 | |
| Citometro a flusso FC 500 | Beckman Coulter Inc. | n/d | |
| Macinatore di tessuti in vetro Kontes | Kontes Corp | 885300-0015 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | n/d | |
| Ago | BD Biosciences | 305175 | |
| Parafilm "M" | Pechiney Plastic Packaging | PM992 | |
| Paraformaldeide | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| PBS | GIBCO, di Life Technologies | 10010-023 | |
| Reagente lisante PharmLyse | BD Biosciences | 555899 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, di Life Technologies | 11875-093 | |
| Siringa | BD Biosciences | 309602 | |
| Vybrant CFSE Kit | Invitrogen | V12883 |
Riferimenti
- Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G., Ahmed, R. Impact of epitope escape on PD-1 expression and CD8 T-cell exhaustion during chronic infection. J Virol. 83 (9), 4386-4394 (2009).
- Jenkins, M. R., Tsun, A., Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M.
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Ristampe e permessi
