La struttura 3-D di una molecola fornisce una comprensione unica del funzionamento molecola. Il metodo principale per la determinazione della struttura a quasi atomico risoluzione è cristallografia a raggi X. Qui, dimostra i metodi attuali per ottenere cristalli tridimensionali di qualunque macromolecola dato che sono adatti per la determinazione della struttura di cristallografia a raggi X.
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Articolo metodologico
Cristallizzazione delle proteine per la cristallografia a raggi X
In questo articolo
Sommario
Abstract
Utilizzando la struttura tridimensionale delle macromolecole biologiche di dedurre il loro funzionamento è uno dei più importanti campi della biologia moderna. La disponibilità di strutture risoluzione atomica fornisce una comprensione profonda e unica funzione della proteina, e aiuta a svelare i meccanismi interni della cellula vivente. Ad oggi, l'86% del Protein Data Bank (rcsb-PDB) le voci sono strutture macromolecolari che sono stati determinati con cristallografia a raggi X.
Per ottenere cristalli adatti per studi cristallografici, la macromolecola (ad esempio proteine, acidi nucleici, proteine-proteine o complessi di proteine-acidi nucleici complesso) deve essere purificato all'omogeneità, o il più vicino possibile alla omogeneità. L'omogeneità della preparazione è un fattore chiave per ottenere cristalli che diffrangere ad alta risoluzione (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Cristallizzazione richiede portando la macromolecola di sovrasaturazione. Il campione deve quindi essere concentrati per la massima concentrazione possibile, senza causare aggregazione o precipitazione della macromolecola (di solito 2-50 mg / mL). Presentazione del campione di agente precipitante in grado di promuovere la nucleazione dei cristalli di proteine nella soluzione, che può portare a grandi tridimensionali cristalli crescente dalla soluzione. Esistono due tecniche principali per ottenere cristalli: diffusione del vapore acqueo e cristallizzazione batch. Nella diffusione del vapore, una goccia contenente una miscela di soluzioni precipitante e proteine è sigillato in una camera con precipitante puro. Il vapore acqueo diffonde poi fuori della goccia fino alla osmolarità della goccia e il precipitante sono uguali (Figura 1A). La disidratazione della goccia provoca una lenta concentrazione di proteine e precipitante fino a quando l'equilibrio è raggiunto, idealmente nella zona di nucleazione cristallina del diagramma di fase. Il metodo si basa sul lotto portando la proteina direttamente nella zona di nucleazione da proteica con la giusta quantità di precipitante (Figura 1B). Questo metodo è di solito eseguita in una paraffina / miscela olio minerale per prevenire la diffusione di acqua dalla caduta.
Qui ci dimostrano due tipi di apparato sperimentale per la diffusione del vapore, appeso goccia e goccia seduti, oltre a cristallizzazione lotto sott'olio.
Protocollo
Materiali:
- Campione di proteine - lisozima (50 mg / ml)
- Hanging goccia 24-ben vassoio
- Seduto goccia 24-ben vassoio
- Microbatch cristallizzazione 96 vassoio bene
- Soluzioni di cristallizzazione (sia commerciale disponibile o fatti in casa)
- Silicon grasso
- Siringa da 5 ml senza Luer-Lock
- Diapositive copertura siliconato
- Nastro di tenuta ottico
- Paraffina
- 0,1-2 micropipetta microlitri con bassa ritenzione suggerimenti
- Pinzetta
- Salviette professionale
1. Hanging / seduta procedura Drop:
- Per una scher....
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Risultati
La cristallizzazione è generalmente considerata il collo di bottiglia della cristallografia a raggi X. Una schermata incompleta a matrice sparsa basata su un disegno sperimentale fattoriale di condizioni precipitanti produce tipicamente molti tipi diversi di aggregazione e precipitazione proteica, tra cui cristalli singoli di grandi dimensioni. Se le concentrazioni della proteina o del precipitante sono troppo elevate, si può osservare una materia scura senza forma né dimensione definite (precipitazione amorfa). Quando l.......
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Discussione
In questo articolo descrivere e dimostrare generali attuali protocolli per la cristallizzazione della proteina. Dal momento che un multi-step procedura ci sono alcune considerazioni bisogna essere a conoscenza. Quando si lavora con volumi molto piccoli (0,5-2 mL), essiccazione della caduta a causa dell'evaporazione è una preoccupazione importante. Pertanto, si raccomanda di lavorare in un ambiente ben controllato (con flusso aria bassa, alta umidità e controllo della temperatura stretto) e di adottare una tecnica ch.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da una Investigator Award Burroughs Wellcome a YM e da un Brown-Coxe borsa post-dottorato presso la Yale University a MD.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Lisozima | Sigma-aldrich | L6876-1G | |
| Piastra VDX a 24 pozzetti | Hampton research | HR3-142 | |
| Piastra Cryschem a 24 pozzetti | Hampton research | HR3-158 | |
| Grasso da vuoto Dow Corning | Hampton research | HR3-510 | |
| Coverslip di vetro silanizzato | Hampton research | HR3-231 | |
| Olio di paraffina al 100% | Hampton research | HR3-411 | |
| Nastro sigillante Crystal Clear largo 1,88 pollici | Hampton research | HR3-511 | |
| Piastra Imp@ct a 96 pozzetti (piastra per microbatch) | Hampton research | HR3-098 |
Riferimenti
- Bergfors, T. M. Protein crystallization : techniques, strategies, and tips : a laboratory manual. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).
- Carter, C. W., Carter, C. W. Protein crystallization using incomplete factorial experiments. J Biol Chem. 254....
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Ristampe e permessi
