Reverse approcci genetici si sono dimostrati estremamente utili per determinare quali geni di resistenza agli agenti patogeni sottostanti vettore nelle zanzare. Questo protocollo video illustra un metodo utilizzato dal laboratorio Dimopoulos per iniettare dsRNA in zanzare Anopheles gambiae, che ospitano il parassita della malaria. La tecnica di manipolare la configurazione di iniezione e iniezione di dsRNA nel torace è illustrato.
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Articolo metodologico
Protocollo per saggi RNAi in zanzare adulte (A. gambiae)
In questo articolo
Sommario
Abstract
Reverse approcci genetici si sono dimostrati estremamente utili per determinare quali geni di resistenza agli agenti patogeni sottostanti vettore nelle zanzare. Questo protocollo video illustra un metodo utilizzato dal laboratorio Dimopoulos per iniettare dsRNA in zanzare Anopheles gambiae, che ospitano il parassita della malaria. La tecnica di manipolare la configurazione di iniezione e iniezione di dsRNA nel torace è illustrato.
Protocollo
RNAi mediato silenziamento genico nelle zanzare richiede una preparazione preventiva e la purificazione della dsRNAs specifici che colpiscono il gene di interesse. Per la sintesi di dsRNA, si consiglia il kit Megascript Ambion che si avvale di un RNA polimerasi T7-mediata reazione di trascrizione in vitro. Per la purificazione dsRNA, si consiglia il kit Qiagen RNeasy. Campioni di dsRNA devono essere quantificati e regolata a 3 g / mL in acqua. Altri materiali è necessario includere: punta fine pinze, vetrino, aghi di vetro microcapillare, microinjector (usiamo Drummond Nanoject II), un microscopio ottico montato sopra un blocco freddo, una coperta piatto di ....
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Discussione
Efficienza del silenziamento genico è altamente variabile e dipende da una serie di fattori tra cui trascrizione e proteine turn-over tassi ed efficienza dsRNA assorbimento da parte delle cellule e organi. Abbiamo scoperto che il silenziamento inizia già dopo 1 iniezione al giorno e può durare fino a 6 giorni dopo l'iniezione. Utilizzare metodi di rilevamento trascrizione e proteine, come la PCR quantitativa e Western blotting per convalidare tacere.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti | |
|---|---|---|---|---|
| Megascript | kit | Ambion | per la sintesi di RNA a doppio filamento; reazione di trascrizione in vitro mediata da RNA polimerasi T7 | |
| RNeasy | Qiagen | Per la purificazione di RNA a doppio filamento | ||
| dsRNA | deve essere quantificato e aggiustato a 3 μg/ μL in acqua | |||
| pinzette con punta fine | ||||
| vetrino in vetro | ||||
| ago capillare in vetro | ||||
| microiniettore | Drummond Scientific | Nanoject II | ||
| microscopio ottico | montato sopra un blocco freddo | |||
| piastra di Petri | coperta, in vetro | |||
| carta assorbente | ||||
| saccarosio al 10% | alimento | |||
| A. gambiae | Animale | zanzare |
Riferimenti
- Boisson,, et al. , (2006).
- Blandin,, et al. , (2002).
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Ristampe e permessi
