Il modello murino di In utero Trapianto è uno strumento versatile che può essere utilizzato per studiare le potenziali applicazioni cliniche di trapianto di cellule staminali e la terapia genica nel feto. In questo protocollo, vi presentiamo un approccio generale di eseguire questa tecnica
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Articolo metodologico
Un modello murino di Nell'utero Trapianto
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il trapianto di cellule staminali in utero e virus ha un potenziale enorme per il trattamento di malattie congenite nel feto umano. Per esempio, nel trapianto di utero (IUT) di cellule staminali ematopoietiche è stato usato per trattare con successo pazienti con grave immunodeficienza combinata 1,2. In altre condizioni, tuttavia, IUT è stata tentata senza successo. 3 Alla luce di questi risultati contrastanti, la disponibilità di un efficiente non umani modello per studiare le conseguenze biologiche del trapianto di cellule staminali e la terapia genica è fondamentale per far avanzare questo campo. Noi e altri ricercatori hanno utilizzato il modello murino di IUT di studiare fattori che influenzano il successo di attecchimento in utero trapiantato cellule staminali ematopoietiche in entrambi i topi wild-type 4-7 e quelli con malattie genetiche. 8,9 L'ambiente fetale offre anche notevoli vantaggi per l' successo della terapia genica in utero. Per esempio, la consegna di adenovirali 10, virale adeno-associato 10, retrovirali 11 e vettori lentivirali 12,13 nel feto ha portato alla trasduzione degli organi più distanti dal sito di iniezione a lungo termine l'espressione genica. Nell'utero La terapia genica può quindi essere considerato come una possibile strategia di trattamento per i disturbi del singolo gene come la distrofia muscolare o la fibrosi cistica. Un altro potenziale vantaggio del IUT è la capacità di indurre tolleranza immunitaria ad un antigene specifico. Come si è visto nei topi affetti da emofilia, l'introduzione del fattore IX presto risultati di sviluppo della tolleranza a questa proteina 14.
In aggiunta al suo utilizzo nelle indagini potenziali terapie umane, il modello murino di IUT può essere un potente strumento di riflessione su questioni di base in biologia cellulare e dello sviluppo staminali. Per esempio, si possono fornire diverse piccole molecole di indurre o di inibire l'espressione del gene specifico a definire le fasi di gestazione e manipolare i percorsi di sviluppo. L'impatto di queste alterazioni possono essere valutate in punti temporali diversi dopo il trapianto iniziale. Inoltre, si possono trapiantare pluripotenti o lignaggio cellule progenitrici specifici nell'ambiente fetale per studiare la differenziazione delle cellule staminali in un ambiente host non irradiato e imperturbabile.
Il modello murino di IUT ha già fornito numerose intuizioni nei settori di immunologia e biologia cellulare e dello sviluppo staminali. In questo video basato su protocollo, si descrive passo-passo approccio a svolgere IUT in feti di topo e indicare le tappe critiche e potenziali insidie di questa tecnica.
Protocollo
1. Preparazione del Pipette iniezione
- Calibrare l'estrattore pipetta in modo tale che la separazione della pipetta di vetro avviene entro 15 secondi (vedere le istruzioni del produttore per quanto riguarda la taratura). La pipetta avrà un cono in cui separa.
- Tagliare l'estremità della pipetta in modo che la distanza dall'inizio del cono fino alla fine della pipetta è 1,04 centimetri a 1,05 centimetri. La lunghezza della pipetta è inversamente proporzionale al calibro dell'orifizio pipetta. Essere consapevoli del fatto che per fare una pipetta di più provoca anche una punta più debole che è più suscettibile alle rotture durante l'iniezione. <....
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Discussione
Oltre 50 anni fa, Billingham, Brent e Medawar utilizzati in utero trapianto nei topi per indurre tolleranza immunitaria a proteine estranee. 16 Da allora, diverse varianti di questa tecnica sono stati utilizzati per affrontare le questioni in immunologia e la biologia delle cellule staminali.
Il protocollo dettagliato qui è uno dei metodi più accessibile per IUT. Il fegato fetale propone un obiettivo facilmente visualizzati e fornisce l'accesso alla circolazione sis.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Vorremmo riconoscere le nostre fonti di finanziamento: Il California Institute for Training rigenerativa di Grant Fellow Medicina Clinica (AN), National Science Foundation (MW), Irene Premio Perstein (TCM), American College of Surgeons (TCM), American Pediatric Surgical Association ( TCM), e il March of Dimes (TCM).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pipette | Kimble Chase | 71900-100 | |
| Tiratore di pipette | Sutter Instrument Co. | Modello P-30 | |
| Micropipettatore | Narishige International | IM-300 | |
| Affilatore di pipette | Sutter Instrument Co. | Modello BV-10 |
Riferimenti
- Flake, A. W. Treatment of X-linked severe combined immunodeficiency by in utero transplantation of paternal bone marrow. N Engl J Med. 335, 1806-1810 (1996).
- Wengler, G. S.
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Ristampe e permessi
