Combinazione di nastro adesivo a base di campionamento e di fluorescenza In situ per il rilevamento rapido di Salmonella Su prodotti freschi

Sommario

Questo protocollo descrive un semplice nastro adesivo a base di approccio per il campionamento di pomodoro e di altre superfici di prodotti freschi, seguita da una rapida individuazione cellule intere di Salmonella Usando fluorescenza In situ Ibridazione (FISH).

Abstract

Questo protocollo descrive un metodo semplice per nastro adesivo a base di campionamento di pomodoro e di altre superfici di prodotti freschi, seguita da su-nastro ibridazione in situ fluorescente (FISH) per una rapida indipendente dalla cultura di rilevamento di Salmonella spp. Nastri Cell-paga può anche essere posizionato a faccia in giù su agar selettivo per fase solida arricchimento prima rilevazione. In alternativa, a basso volume arricchimenti liquido (miniculture superficie liquida) può essere effettuata sulla superficie del nastro in brodo non selettivo, seguito da FISH e analisi mediante citometria a flusso. Per iniziare, nastro adesivo sterile è portato a contatto con prodotti freschi, una leggera pressione viene applicata, e il nastro viene rimosso, fisicamente estrazione microbi presenti su queste superfici. I nastri sono montati appiccicosa rivolta verso l'alto su vetrini da microscopio in vetro e le cellule campionate sono fissati con formalina al 10% (30 min) e disidratati attraverso una serie graduata di etanolo (50, 80, e il 95%; 3 minuti per ogni concentrazione). Successivamente, cellule carica nastri sono macchiati con tampone contenente un cocktail mirato Salmonella sonda di DNA e ibridato per 15 - 30 min a 55 ° C, seguita da un breve risciacquo in un buffer di lavaggio per rimuovere la sonda non legata. Aderente, PESCE-etichettati cellule sono poi di contrasto con il DNA colorante 4 ',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) ed i risultati sono visualizzati mediante microscopia a fluorescenza. Per la fase solida arricchimento, la cella a carica nastri sono disposti a faccia in giù su una superficie adatta agar selettivi e incubate per consentire la crescita in situ di microcolonie Salmonella, seguita dalla FISH e microscopia come descritto sopra. Per miniculture superficie del liquido, la cella a carica nastri sono disposti lato adesivo e una camera di perfusione di silicone viene applicato in modo che il nastro e far scorrere forma microscopio il fondo di una camera a tenuta stagna in cui un piccolo volume (≤ 500 mL) di Trypticase soia Broth (TSB) è introdotto. I condotti di aspirazione sono sigillati e le camere sono incubate a 35 - 37 ° C, permettendo una crescita a base di amplificazione del nastro estratto microbi. Dopo l'incubazione, condotti di aspirazione sono sigillate, le cellule si staccano e mescolato con schiena vigorosa e indietro pipettaggio, raccolte tramite centrifugazione e fissato nel 10% formalina tamponata neutra. Infine, i campioni sono ibridate e esaminati attraverso la citometria a flusso per rivelare la presenza di Salmonella spp. Come descritto qui, il nostro approccio "nastro-FISH" in grado di fornire campionamento semplice e rapida e la rilevazione di Salmonella sulle superfici di pomodoro. Abbiamo inoltre usato questo metodo per il campionamento di altri tipi di prodotti freschi, tra cui spinaci e peperoni jalapeño.

Protocollo

1. Campionamento superficie con del nastro adesivo sterile

1. Selezionare un nastro da utilizzare per il campionamento. Disponibili in commercio funghi-Tape o Con-Tatto-It nastri di campionamento sono sterili e appositamente confezionati per la facilità d'uso. Tuttavia, abbiamo scoperto che trasparente (otticamente chiaro) nastro ufficio generico può anche essere usato.
2. Utilizzare un pennarello indelebile per disegnare 1 cm ² quadrati sulla non appiccicoso lato di un pezzo di 10 centimetri di nastro adesivo (un modello di carta può essere utilizzata). Questo servirà come guida visuale per notare che parte del nastro è stato utilizzato per....

Discussione

Metodi semplici e rapidi per l'individuazione di agenti patogeni sulle superfici producono possono contribuire a mitigare le malattie di origine alimentare, fornendo dati tempestivi e fruibili. Nastro adesivo a base di metodi di campionamento sono stati utilizzati in termini ambientali, cliniche e microbiologia degli alimenti fin dal 1950 e coinvolgono pressione del tipo "Scotch" nastro alle superfici per la rimozione dei microrganismi, seguito dal diretto esame microscopico o il trasferimento di microrgan.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nastro di campionamento Fungi-Tape	Scientific Device Laboratory	745	http://www.scientificdevice.com/
Con-Tact-It nastro di campionamento	Birko Corporation, Denver, CO		http://www.birkocorp.com/
Nastro da ufficio trasparente, generico	Vari		Dovrebbe essere otticamente trasparente, avere una bassa fluorescenza intrinseca
Superficie alimentare	Negozio		di alimentari localeTomat– s (tomat rosso– s sulla vite, non cerata o oliata) qui
utilizzato Trypticase Brodo di soia	Difco Laboratories	211768	Per l'arricchimento di minicolture superficiali liquide non selettive
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base	Difco Laboratories	223420	For Salmonella-agar selettivo (XLT-4)
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement	Difco Laboratories	235310	Per Salmonella agar selettivo (XLT-4)
Soluzione di formalina	Sigma-Aldrich	HT5011	Soluzione al 10%, neutra, tamponata (fissativo cellulare)
Etanolo assoluto	Sigma-Aldrich	E7023	Grado di biologia molecolare (disidratazione pre-ibridazione)
Provette per microcentrifuga da 1,5 ml	Vari		e vetrini coprioggetti privi di RNasi e DNasi
	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Soluzione di NaCl	Sigma-Aldrich	S5150	Grado di biologia molecolare, soluzione 5M (componente tampone di ibridazione)
Soluzione tampone Tris-EDTA (concentrato 100X)	Sigma-Aldrich	T9285	1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (componente tampone di ibridazione)
Soluzione di sodio dodecil solfato	Soluzione Sigma-Aldrich	L4522	al 10% in acqua da 18 megaohm (tampone di ibridazione sonde
oligonucleotidiche Sal3 e Salm-63 Tecnologie	DNA integrate Marcato		con 5' con 6-carbossifluoresceina (FAM) o Texas Red (per la microscopia) o Cy5 (per la citometria), purificato con HPLC
Microcentrifuga a velocità variabile	Vari		Utilizzare il diametro del rotore per calcolare il numero di giri necessario per i valori RCF descritti nel protocollo
Camera di perfusione CoverWell	Grace Bio-Lab Inc.	PC1R-2.0	Puntali per
pipette con caricamento in gel non sterili (FS MultiFlex)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	05-408-151	Punte lunghe e sottili per un facile accesso a piccole porte di campionamento e manovrabilità all'interno della camera
Blocco termico in alluminio o stazione di riscaldamento controllata con precisione	Vari		agitatori di riscaldamento e raffreddamento a blocco secco Eppendorf Thermomixer R utilizzati qui
Mini forno di ibridazione	Boekel Scientific	Modello 230300	I vetrini sono posti in provette da centrifuga in polipropilene da 50 ml per l'ibridazione, il trasferimento di calore non Ibridatore
di vetrini a scivolo	diretto Boekel	Scientific Modello 240000	Fornisce una trasmissione rapida e diretta del calore attraverso
il supporto di montaggio Vectashield H-1200 con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)	Vector Laboratories	H-1200	Riduce al minimo l'estinzione della fluorescenza durante la microscopia, fornisce un colorante di contrasto DAPI
Microscopio a fluorescenza	Vari		Leitz Laborlux S usato qui
Fotocamera digitale	Vari		Canon PowerShot A640 fotocamera utilizzata qui
Software di acquisizione immagini	Vari		software Axiovision v. 4.6 (Carl Zeiss) utilizzato
Adobe Photoshop	Adobe		Per l'elaborazione minima delle immagini (sovrapposizione di immagini scattate in canali diversi)
Citometro a flusso	Vari		Citometro a flusso FACSCanto (BD Biosciences, San Jose, CA) con eccitazione rossa (647 nm) utilizzato
Software di analisi della citometria a flusso	Vari		software FlowJo v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) utilizzati