Combinazione di nastro adesivo a base di campionamento e di fluorescenza In situ per il rilevamento rapido di Salmonella Su prodotti freschi

Sommario

Questo protocollo descrive un semplice nastro adesivo a base di approccio per il campionamento di pomodoro e di altre superfici di prodotti freschi, seguita da una rapida individuazione cellule intere di Salmonella Usando fluorescenza In situ Ibridazione (FISH).

Abstract

Questo protocollo descrive un metodo semplice per nastro adesivo a base di campionamento di pomodoro e di altre superfici di prodotti freschi, seguita da su-nastro ibridazione in situ fluorescente (FISH) per una rapida indipendente dalla cultura di rilevamento di Salmonella spp. Nastri Cell-paga può anche essere posizionato a faccia in giù su agar selettivo per fase solida arricchimento prima rilevazione. In alternativa, a basso volume arricchimenti liquido (miniculture superficie liquida) può essere effettuata sulla superficie del nastro in brodo non selettivo, seguito da FISH e analisi mediante citometria a flusso. Per iniziare, nastro adesivo sterile è portato a contatto con prodotti freschi, una leggera pressione viene applicata, e il nastro viene rimosso, fisicamente estrazione microbi presenti su queste superfici. I nastri sono montati appiccicosa rivolta verso l'alto su vetrini da microscopio in vetro e le cellule campionate sono fissati con formalina al 10% (30 min) e disidratati attraverso una serie graduata di etanolo (50, 80, e il 95%; 3 minuti per ogni concentrazione). Successivamente, cellule carica nastri sono macchiati con tampone contenente un cocktail mirato Salmonella sonda di DNA e ibridato per 15 - 30 min a 55 ° C, seguita da un breve risciacquo in un buffer di lavaggio per rimuovere la sonda non legata. Aderente, PESCE-etichettati cellule sono poi di contrasto con il DNA colorante 4 ',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) ed i risultati sono visualizzati mediante microscopia a fluorescenza. Per la fase solida arricchimento, la cella a carica nastri sono disposti a faccia in giù su una superficie adatta agar selettivi e incubate per consentire la crescita in situ di microcolonie Salmonella, seguita dalla FISH e microscopia come descritto sopra. Per miniculture superficie del liquido, la cella a carica nastri sono disposti lato adesivo e una camera di perfusione di silicone viene applicato in modo che il nastro e far scorrere forma microscopio il fondo di una camera a tenuta stagna in cui un piccolo volume (≤ 500 mL) di Trypticase soia Broth (TSB) è introdotto. I condotti di aspirazione sono sigillati e le camere sono incubate a 35 - 37 ° C, permettendo una crescita a base di amplificazione del nastro estratto microbi. Dopo l'incubazione, condotti di aspirazione sono sigillate, le cellule si staccano e mescolato con schiena vigorosa e indietro pipettaggio, raccolte tramite centrifugazione e fissato nel 10% formalina tamponata neutra. Infine, i campioni sono ibridate e esaminati attraverso la citometria a flusso per rivelare la presenza di Salmonella spp. Come descritto qui, il nostro approccio "nastro-FISH" in grado di fornire campionamento semplice e rapida e la rilevazione di Salmonella sulle superfici di pomodoro. Abbiamo inoltre usato questo metodo per il campionamento di altri tipi di prodotti freschi, tra cui spinaci e peperoni jalapeño.

Protocollo

1. Campionamento superficie con del nastro adesivo sterile

1. Selezionare un nastro da utilizzare per il campionamento. Disponibili in commercio funghi-Tape o Con-Tatto-It nastri di campionamento sono sterili e appositamente confezionati per la facilità d'uso. Tuttavia, abbiamo scoperto che trasparente (otticamente chiaro) nastro ufficio generico può anche essere usato.
2. Utilizzare un pennarello indelebile per disegnare 1 cm ² quadrati sulla non appiccicoso lato di un pezzo di 10 centimetri di nastro adesivo (un modello di carta può essere utilizzata). Questo servirà come guida visuale per notare che parte del nastro è stato utilizzato per campionare la superficie alimentare o ambientale.
3. Formare una "C" a forma di anello di nastro, con la parte adesiva verso la superficie da campionare. Per fare questo, tenere le estremità adesive con il pollice e il medio e posizionare il dito indice contro il quadrato disegnato sul retro (non appiccicosa lato) del nastro (Figura 1).
4. Posizionare il nastro sulla superficie da campionare e premere delicatamente la zona segnata contro la superficie. Senza rilasciare i bordi del nastro, utilizzare il dito indice per garantire che la parte adesiva del nastro viene a contatto con la superficie del campione, evitando le bolle.
5. Utilizzando un movimento anche, tirare lentamente il nastro lontano dal campione, l'estrazione di superficie fisicamente legato microbi. Fissare la cellula carica nastri, lato adesivo alto, su un vetrino di vetro con il nastro trasparente generico ufficio. Garantire la giusta tensione / allungamento del nastro in modo che un appartamento, non rugosa superficie è creato. Questo aiuterà a ridurre i problemi di deformazione / arricciatura del nastro durante il successivo riscaldamento durante l'ibridazione.

2. Fase solida arricchimento e Miniculture superficie del liquido

1. In fase solida arricchimento viene eseguito ponendo il nastro a faccia in giù su xilosio-lisina-Tergitol 4 (XLT-4) piastre di agar in modo che le cellule campionate sono posti in contatto diretto con la superficie agar. La parte templated contatto / campione del nastro è posto a filo con la superficie di agar e una delle estremità del nastro è liberamente aderito alla parete laterale della scatola di Petri di facilitarne la rimozione del nastro dalla superficie agar seguenti arricchimento.
2. Le piastre sono invertiti (per evitare la condensazione) e incubate a 35 - 37 ° C per consentire una crescita sufficiente di Salmonella spp. La lunghezza del periodo di incubazione necessario per arricchire le cellule ad un livello rilevabile dipende dai livelli iniziali contaminazione da Salmonella. Abbiamo osservato la formazione eccellente microcolony dal basso inoculo iniziale dopo 8 ore di arricchimento.
3. Dopo il periodo di arricchimento desiderato, aprire la piastra di agar. Il nastro manterrà la sua appiccicosità durante l'incubazione. Premere delicatamente il nastro contro l'agar con il dito indice per garantire il recupero massimo di microcolonie formato a nastro-agar interfaccia. Afferrare il nastro dal bordo attaccata alla parete della scatola di Petri e rimuoverlo con un lento, anche il movimento. Montare il cellulare a carica nastro, lato adesivo alto, su un vetrino da microscopio, come descritto al punto 1.5. Procedere al punto "fissazione e disidratazione" di seguito.
4. Per miniculture superficie del liquido, iniziare il fissaggio del nastro utilizzato per il campionamento su un vetrino da microscopio, come descritto al punto 1.5. Successivamente, coprire la parte basati su modelli di contatto / campione del nastro con un non-sterile camera di silicone perfusione (Coverwell, Grace Bio-Labs, Inc.), formando una camera stagna cui fondo è composto di cellule carica nastro, rivolta verso l'alto. Con fermezza, ma premere delicatamente la camera in posizione per assicurare la tenuta stagna.
5. Utilizzando un gel di carico flessibile puntale, trasferimento ≤ 500 microlitri brodo di soia Trypticase o altro mezzo idoneo di arricchimento attraverso una delle porte piccola insenatura della camera. Seal entrambe le porte con del nastro adesivo trasparente ufficio per evitare l'evaporazione diapositive e incubare a 35 -37 ° C come necessario per l'arricchimento sufficiente. Anche se tutte le operazioni devono essere eseguite secondo le buone pratiche di campionamento e la manipolazione, la sterilità di porta-nastro di tenuta o camere perfusione non è necessaria durante miniculture superficie del liquido. La combinazione di FISH e citometria a flusso consentirà discriminazione chiaro di Salmonella spp. da non bersaglio batteri che possono essere presenti, con il più grande contributo di non bersaglio flora dovrebbe provenire dal campione stesso. Procedere al punto "fissazione e disidratazione" di seguito.

3. Fissazione e disidratazione

1. Per il campionamento di superficie diretta o per l'arricchimento in fase solida di Salmonella spp. XLT su agar-4, eseguire on-nastro fissazione delle cellule per 30 minuti a 25 ° C, coprendo l'area di contatto del campione con 500 microlitri 10% formalina tamponata neutra.
2. Scartare fissativo in un contenitore sigillabile (sotto una cappa chimica per minimizzare l'esposizione a irritanti / vapori tossici).
3. Disidratare in una serie di etanolo (50%, 80% e 95%, 300 ml / 3 minuti per ogni concentrazione). Passare al punto "ibridazione" di seguito.
4. Per il fissaggio del campione di 500 microlitri di liquido miniculture superficies, camere di perfusione sono sigillate, e un flessibile gel-loading puntale viene utilizzato per estrarre il enrichate. Pipettaggio rapido su e giù è usato per contribuire ad assicurare la rimozione efficace di qualsiasi nastro residuo legato cellule.
5. Successivamente, l'intero volume di 500 microlitri miniculture è trasferito in una provetta e centrifugare a 2.000 xg (5 min). Il supernatante viene scartato, il pellet è in agitazione energicamente per 30-60 s, quindi risospeso in un volume pari al 10% formalina tamponata neutra. Le cellule sono fissate per 30 minuti a 25 ° C.
6. Successivamente, fissativo viene rimosso e il campione viene risospeso in un tampone di cella di stoccaggio, come segue. Il campione viene centrifugato a 2.000 xg (5 min, 25 ° C) il supernatante viene scartato, il pellet è in agitazione energicamente per 30 - 60 s, il risospesi in un volume pari al 50% di etanolo non denaturato-50%-fosfato soluzione salina tamponata. Cellule fisse possono essere conservati a tempo indeterminato (anni) a -20 ° C. Nota: Ogni volta che i liquidi sono cambiati (ad esempio, quando l'introduzione di un buffer di fissativo o diverso), è importante per sospendere di nuovo a fondo (con vortex) il pellet di cellule in una porzione minima (~ 10-20 mL) del sistema "in uscita" liquido . Questo aiuterà a prevenire aggregazione e di garantire che le sospensioni, anche di singole cellule si ottengono. Passare al punto "ibridazione" di seguito.

4. Ibridazione

1. Preparare ibridazione / tampone di lavaggio utilizzando il commerciale biologia molecolare-grade soluzioni indicato nella tabella dei Materiali. Finale concentrazioni dei componenti del buffer sono 0.7 M di NaCl, 0,1 M TRIS [pH 8,0], 10 mM EDTA, solfato di sodio 0,1% dodecil, composto al volume finale desiderato con molecolare acqua di grado e filtrata con una siringa da 0,22 micron o filtro tazza. Il buffer stesso, senza l'aggiunta di sonde (vedi sotto) è usato come tampone di lavaggio. Preriscaldare il buffer di ibridazione e lavaggio a 55 ° C.
2. Aggiungi fluorescenza marcata Sal3 (Nordentoft et al, 1997;. 5'-AAT CAC TTC ACC TAC GTG-3 ') e Salm-63 (Kutter et al, 2006;. 5'-TCG ACT GAC TTC AGC TCC-3' ) sonde oligonucleotidiche (Tabella Materiali) al buffer di ibridazione preriscaldato. Una concentrazione sonda totale di 5 microlitri ^-1 ng viene utilizzato (ad esempio 2,5 ng microlitri ^-1 ogni sonda; Bisha e Brehm-Stecher, 2009a).
3. Per i campioni di fase direct-to-tape e solida arricchimento, sovrapporre il template area di contatto campione del nastro con 300 l di tampone di ibridazione contenente il cocktail della sonda e ibridare nastro legato cellule in un umido, camera di incubazione sigillata impostato a 55 ° C. Se un contatto diretto come lo strumento Fossato Slide (Tabella Materiali) incubatore è usato, i campioni sono ibridate per 15 min e> 20 diapositive possono essere trattati simultaneamente. Se un rotante in stile fornetto come lo strumento Bambino (Tabella Materiali) è usato, gli scivoli sono posti in provette da 50 ml per centrifuga in polipropilene per l'ibridazione, uno scivolo per provetta. Poiché il trasferimento di calore non è diretto, questi campioni sono ibridate per periodi più lunghi (fino a 30 min).
4. Dopo l'ibridazione, le diapositive vengono rimossi e la sonda overlay contenente tampone di ibridazione viene scartato. Le diapositive vengono poi brevemente e delicatamente sciacquati con preriscaldato tampone di lavaggio pipettando un piccolo volume di tampone su un vetrino inclinato (3 risciacqui di 300 ogni mL), o formalmente lavato (fino a 30 min) o con una sovrapposizione di tampone di lavaggio preriscaldato o immersione in un tubo di polipropilene da 50 ml per centrifuga contenente tampone preriscaldato lavaggio. Nella nostra esperienza, anche se un lavaggio formale fornirà risultati migliori (meno foschia dalla sonda non legata), un semplice risciacquo è sufficiente per l'individuazione univoca di Salmonella spp. Successivamente, le diapositive sono essiccati all'aria, prima di passare alla fase "Rivelazione" di seguito.
5. Ibridazione di campioni liquidi miniculture superficie viene effettuata riducendo la velocità campioni (fresco fisso o tenuti in soluzione per la conservazione a -20 ° C) per 5 min a 2.000 xg, seguita da vortex vigorosa del pellet e risospensione in 100 microlitri di buffer di ibridazione preriscaldato contenente la sonda cocktail. I campioni sono ibridate a 55 ° C per 30 minuti su un blocco di calore o di altri stazione incubazione adatto (Tabella Materiali), seguita da aggiunta di 500 microlitri di lavaggio tampone preriscaldato. Come con il nastro legato campioni, questi campioni possono essere lavati formalmente per un massimo di 30 minuti con ulteriore incubazione a 55 ° C in questo tampone di lavaggio, con vortex intermittente. In alternativa, i campioni possono essere completamente in agitazione dopo l'aggiunta di 500 microlitri di buffer di lavaggio preriscaldato, seguita dalla raccolta immediata per l'analisi (in basso).
6. In preparazione per il rilevamento di Salmonella spp. mediante citometria a flusso, i campioni di liquido miniculture superficie sono centrifugare a 2.000 xg per 5 minuti, il supernatante viene scartato ed i campioni sono risospesi in 300 microlitri temperatura ambiente (~ 25 ° C) PBS. Se i campioni necessitano di trasporto in una struttura lontana, o se il ritardo è prevista tra ibridazione e di analisi, i campioni possono essere refrigerati o in attesa sul ghiaccio prima di analisi. In alternativa, i campioni possono essere trasferiti al buffer di cella di stoccaggio (50:50 miscela di PBS e etanolo assoluto) e ha tenuto a -20 ° C per un massimo di una settimana senza perdite apprezzabili sonda conferito fluorescenza (Bisha e Brehm-Stecher, 2009b) .

5. Rivelazione

1. Per il nastro di rilevamento di Salmonella spp. tramite microscopia a fluorescenza, direct-to-tape o solido campioni arricchimento fase sono sovrapposti con ~ 10 L Vectashield H-1200 mezzo di montaggio contenente il nucleare di contrasto 4 ',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI), montati con un vetrino, poi incubate al buio per 10 minuti.
2. Olio di immersione è posto sul vetrino, e campioni vengono esaminati con un alto ingrandimento obiettivo olio (63x e 100x). Il filtro DAPI viene utilizzato per portare il campione a fuoco, il microscopio è poi passato al filtro appropriato (verde o rosso, a seconda del colorante usato per terminare le sonde-label) e le cellule di Salmonella sono segnato visivamente in base alla loro fluorescenza (figure 2 e 3).
3. Per il rilevamento mediante citometria di campioni liquidi miniculture superficie, vari strumenti possono essere utilizzati, a seconda della disponibilità locale. Nel nostro laboratorio, PBS, sospeso campioni vengono trasferiti in provette da 5 mL fondo di campionamento (BD Falcon) ed esaminato usando un citofluorimetro FACSCanto con eccitazione a 647 nm (tabella materiali). Per i campioni arricchito contenente un numero elevato di batteri totale, il "basso flusso" impostazione (10 L min ^-1) è usato e 5,000-50,000 eventi vengono raccolti. I dati sono analizzati utilizzando FlowJo software (versione 8.8.6, Albero Star, Inc., Ashland, OR) o altri software di analisi idoneo (Figura 4, pannelli A e B).

6. Rappresentante Risultati

Figura 1. L'uso di nastro adesivo per il campionamento di Salmonella spp. dalla superficie di un pomodoro artificialmente contaminata.

Figura 2. I risultati tipici di direct-to-tape campionamento e l'individuazione del pesce di Salmonella Typhimurium ATCC 14028 dalla superficie di un pomodoro (100 obiettivo olio X). Sonda a due cocktail di Texas Red sonde marcate (Sal3/Salm-63) è stato utilizzato ad etichettare queste cellule.

Figura 3. Microcolonie di Salmonella Typhimurium ATCC 14028 formata sulla superficie del xilosio lisina Tergitol-4 (XLT-4) agar dopo un h 8 su nastro di arricchimento a 37 ° C. L'inoculo iniziale è stato prelevato dalla superficie di un pomodoro artificialmente contaminata. In fase solida arricchimento aumenta il numero di cellule disponibili per la rilevazione e migliora anche cellulari contenuto rRNA.

Figura 4. L'uso di nastro adesivo per il campionamento di S. enterica sierotipo Typhimurium dalla superficie di un pomodoro artificialmente contaminata, seguita da un'analisi diretta tramite FISH e citometria a flusso (pannello A) o dopo 5 ore di arricchimento non selettivo liquido miniculture superficie in una camera di perfusione pieno di 500 microlitri Trypticase Soy Broth (pannello B ).

Discussione

Metodi semplici e rapidi per l'individuazione di agenti patogeni sulle superfici producono possono contribuire a mitigare le malattie di origine alimentare, fornendo dati tempestivi e fruibili. Nastro adesivo a base di metodi di campionamento sono stati utilizzati in termini ambientali, cliniche e microbiologia degli alimenti fin dal 1950 e coinvolgono pressione del tipo "Scotch" nastro alle superfici per la rimozione dei microrganismi, seguito dal diretto esame microscopico o il trasferimento di microrgan...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
nastro per campionamento Fungi-Tape	Laboratorio di Dispositivi Scientifici	745	http://www.scientificdevice.com/
nastro per campionamento Con-Tact-It	Birko Corporation, Denver, CO		http://www.birkocorp.com/
Nastro adesivo trasparente, generico	Vari		Deve essere otticamente trasparente e avere una bassa fluorescenza intrinseca
Superficie degli alimenti	Negozio di alimentari locale		Pomodoro–s (pomodoro rosso–sulla vite, non cerati né oliati) utilizzati in questo caso
Brodo al soia tripticasato	Difco Laboratories	211768	Per l'arricchimento in coltura minima non selettiva su superficie liquida
Base di agar per Xylose-lysina-Tergitol 4	Difco Laboratories	223420	Per Salmonellaagar selettivo (XLT-4)
Supplemento per agar xilosio-lisina-Tergitol 4	Difco Laboratories	235310	Per Salmonellaagar selettivo (XLT-4)
Soluzione di formalina	Sigma-Aldrich	HT5011	soluzione al 10%, neutra, tamponata (fissativo per cellule)
Etanolo assoluto	Sigma-Aldrich	E7023	Grado di biologia molecolare (disidratazione pre-ibridazione)
Tubi microcentrifuga da 1,5 ml	Vari vari		privi di RNasi e DNasi
Vetrini e coprioggetti per microscopio	Thermo Fisher Scientific, Inc.
soluzione di NaCl	Sigma-Aldrich	S5150	Grado biologia molecolare, soluzione 5 M (componente del buffer di ibridazione)
Soluzione tampone Tris-EDTA (concentrato 100X)	Sigma-Aldrich	T9285	1 M Tris [pH 8,0], 0,1 M EDTA (componente del buffer di ibridazione)
Soluzione di sodio dodecilsolfato	Sigma-Aldrich	L4522	soluzione al 10% in acqua da 18 megohm (componente del buffer di ibridazione)
Sondi oligonucleotidici Sal3 e Salm-63	Integrated DNA Technologies		5’etichettati con 6-carbossifluoresceina (FAM) o Texas Red (per microscopia) o Cy5 (per citometria), purificati mediante HPLC
Microcentrifuga a velocità variabile	Vari vari		Utilizzare il diametro del rotore per calcolare le RPM necessarie per i valori di RCF descritti nel protocollo
Camera di perfusione CoverWell	Grace Bio-Lab Inc.	PC1R-2.0	Non sterile
Punte per pipetta per caricamento gel (FS MultiFlex)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	05-408-151	Punte lunghe e sottili per un facile accesso a porti di campionamento di piccole dimensioni e una buona manovrabilità all'interno della camera
Blocco riscaldante in alluminio o stazione di riscaldamento a controllo preciso	Vari vari		Eppendorf Thermomixer R agitatore con blocco termico a secco per riscaldamento e raffreddamento utilizzato in questo contesto
Forno di ibridazione mini Bambino	Boekel Scientific	Modello 230300	I vetrini vengono posizionati in provette centrifughe polipropileniche da 50 ml per l'ibridazione, trasferimento termico indiretto
Ibridizzatore per vetrini Slide Moat	Boekel Scientific	Modello 240000	Fornisce una trasmissione rapida e diretta del calore attraverso il vetrino
Vectashield H-1200 mezzo di montaggio con 4’,6-diammidino-2-fenilindolo (DAPI)	Vector Laboratories	H-1200	Minimizza lo spegnimento della fluorescenza durante la microscopia, fornisce controcolorazione con DAPI
Microscopio a fluorescenza	Vari		Leitz Laborlux S utilizzato in questo caso
Fotocamera digitale	Vari vari		Fotocamera Canon PowerShot A640 utilizzata in questo contesto
Software per l'acquisizione delle immagini	Vari vari		Software Axiovision v. 4.6 (Carl Zeiss) utilizzato
Adobe Photoshop	Adobe		Per l'elaborazione minima delle immagini (sovrapposizione di immagini acquisite in diversi canali)
Citometro a flusso	Vari		Citometro a flusso FACSCanto (BD Biosciences, San Jose, CA) con eccitazione rossa (647 nm) utilizzata
Software per l'analisi di citometria a flusso	Vari vari		Software FlowJo v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) utilizzato