Questo documento descrive la metodologia per determinare la risposta chemiotattica dei leucociti ai ligandi specifici e identificare le interazioni tra recettori di superficie della cellula e le proteine citosoliche utilizzando vivere tecniche di imaging cellulare.
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Articolo metodologico
In tempo reale immagini di leucotriene B 4 Migrazione cellulare mediata e BLT1 Interazioni con β-arrestina
In questo articolo
Sommario
Abstract
Recettori accoppiati alla proteina G (GPCR) appartengono alla famiglia delle sette proteine transmembrana e mediare la trasduzione di segnali extracellulari alle risposte intracellulari. GPCR controllo diverse funzioni biologiche come la chemiotassi, rilascio del calcio intracellulare, regolazione genica in modo ligando dipendente tramite eterotrimeriche proteine G 1-2. Di legame induce una serie di cambiamenti conformazionali che portano all'attivazione di eterotrimeriche G-proteine che modulano i livelli di secondi messaggeri come adenosina monofosfato ciclico (cAMP), inositolo trifosfato (IP3) e glicerolo diacyl (DG). In concomitanza con l'attivazione del legame con il ligando del recettore avvia anche una serie di eventi per attenuare il recettore di segnalazione tramite desensibilizzazione, sequestro e / o internalizzazione. Il processo di desensibilizzazione dei GPCR avviene attraverso la fosforilazione del recettore per G-proteina chinasi del recettore (GRKs) e vincolante successiva β-arrestine 3. β-arrestine sono proteine citosoliche e traslocare a membrana su attivazione GPCR, legandosi ai recettori fosforilati (la maggior parte dei casi) ci internalizzazione del recettore, facilitando 4-6.
Leucotriene B 4 (LTB 4) è un pro-infiammatorie molecola lipidica derivati dal percorso di acido arachidonico e media tramite le sue azioni GPCR, LTB 4 recettore 1 (BLT1, un recettore ad alta affinità) e LTB 4 recettore 2 (BLT2, un recettore a bassa affinità ) 7-9. Il 4-BLT1 LTB percorso ha dimostrato di essere critici in diverse malattie infiammatorie tra cui, l'asma, l'artrite e l'aterosclerosi 10-17. Nel documento descrive le metodologie sviluppate per il monitoraggio LTB4-indotto migrazione dei leucociti e le interazioni di BLT1 con β-arrestina e traslocazione dei recettori in cellule vive utilizzando tecniche di imaging microscopia 18-19.
Il midollo osseo le cellule dendritiche derivate da C57BL / 6 topi sono state isolate e coltivate come descritto in precedenza 20-21. Queste cellule sono state testate dal vivo nei metodi di imaging cellulare per dimostrare LTB 4 migrazione cellulare indotta. Il BLT1 umano è stato taggati con rosso proteina fluorescente (BLT1-RFP) a C-terminale e β-arrestin1 taggati con proteina fluorescente verde (β-arr-GFP) e transfettate entrambi i plasmidi in Rat basofili Leukomia (RBL-2H3) linee cellulari 18-19. La cinetica di interazione tra queste proteine e localizzazione sono stati monitorati utilizzando vivere videomicroscopia cellulare. Le metodologie nel documento corrente descrivono l'uso di tecniche microscopiche per studiare le risposte funzionali di G recettori accoppiati alle proteine in cellule vive. Nel documento descrive inoltre l'utilizzo di software Metamorph per quantificare l'intensità di fluorescenza per determinare la cinetica dei recettori e le interazioni proteina citoplasmatica.
Protocollo
Metodologia
Descrizione del microscopio
Dal vivo gli esperimenti di imaging cellulare eseguita utilizzando TE-FM Epi-Fluorescenza sistema collegato al microscopio invertito Nikon Eclipse TE300. Il microscopio dotato fase di riscaldamento. Un fresco scatto HQ digitale B / N CCD (Roper scientifico) della fotocamera e LAMDA 10-2 filtro ottico changer (società strumento Sutter) è collegata al microscopio. Lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione sono controllati con ruote filtro e controllato da Lamba 10-2 regolatore ruota portafiltri, Sutter Instruments Co. 500 ms Tempo di esposizione dovrebbe essere sufficiente p....
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Discussione
L'imaging cellulare Live è un potente strumento per dimostrare la funzione e le interazioni delle proteine specifiche che si verificano in tempo reale. I metodi descritti in questo manoscritto mostrano chiaramente che LTB 4 può provocare una rapida migrazione delle cellule dendritiche. Questi metodi non solo ampliare gli aspetti della funzione di LTB 4 tipi di cellule diverse, consentono metodi simili da applicare ad una varietà di altre chemochine e prova la loro efficacia come agenti chemio.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
La ricerca è sostenuta dal National Institutes of concede Salute AI-52381, CA138623 e Kentucky consiglio Lung Cancer Research e il sostegno istituzionale di James Graham Brown Cancer Center.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Linea cellulare di leucemia basofila del ratto (RBL-2H3) o cellule HEK293. | ATCC | CRL-2256 | |
| Delbecco’s modificato di Eagle’s Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995 | |
| RPMI o DMEM senza rosso fenolo | Invitrogen | 11835-030 | |
| Siero fetale bovino | Invitrogen | 16000-044 | |
| L-Glutammina (200 mM) | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillina-streptomicina (10000 U/mL) | Invitrogen | 15140 | |
| Tripsina, 0,05% (1X) con EDTA 4Na, liquida | Invitrogen | 25300 | |
| HEPES (1 M) | Invitrogen | 15630 | |
| Pietrine di vetro sterili da 35 mm con fondo in coprivetrino (spessore 0,17 mm) (Fluoro dishes, WillCo-dish) | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | |
| Cuvetta sterile per Gene Pulser (intervallo tra elettrodi di 0,4 cm) (Bio-Rad) | Bio-Rad | 16552088 | |
| Gene Pulser II elettroporatore | Bio-Rad | ||
| Sistema TE-FM ad epi-fluorescenza collegato al microscopio invertito Nikon Eclipse TE300 | Nikon Instruments | ||
| Metamorph Software | Immagini universali | ||
| Micropipettatrice verticale per trazione | Narishige International | ||
| Micro-Forge M-900 | Narishige International | ||
| Micromanipolatore idraulico MO-188NE | Narishige International | ||
| Manipolatore manuale grosso, MN-188NE | Narishige International | ||
| Costrutti di cDNA: | |||
| cDNA del recettore accoppiato a proteina G marcato con proteina fluorescente rossa in posizione C-terminale (hBLT1-RFP) | Jala et al. 2005 | ||
| cDNA della proteina citosolica marcata con GFPβ-arrestina1-GFP nello studio attuale). | Jala et al. 2005 |
Riferimenti
- Wess, J. G-protein-coupled receptors: molecular mechanisms involved in receptor activation and selectivity of G-protein recognition. FASEB J. 11, 346-354 (1997).
- Gether, U. Uncovering molecular mechanisms involved i....
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Ristampe e permessi
