Modellazione membrane biologiche con Circuiti e misurazione dei segnali elettrici negli assoni: Esercizi di laboratorio per studenti

Sommario

Questa è una dimostrazione di come le membrane biologiche può essere compreso utilizzando modelli elettrici. Abbiamo anche dimostrare le procedure per la registrazione di potenziali d'azione dal cordone nervoso ventrale del gambero per i laboratori di orientamento degli studenti.

Abstract

Questa è una dimostrazione di come i modelli elettrici possono essere utilizzati per caratterizzare le membrane biologiche. Questo esercizio introduce anche la terminologia utilizzata in biofisica elettrofisiologia. La stessa attrezzatura viene utilizzata nel modello di membrana come sui preparati dal vivo. Alcune proprietà di un cordone nervoso isolato sono studiati: potenziali d'azione dei nervi, il reclutamento dei neuroni, e la reattività del cordone nervoso a fattori ambientali.

Protocollo

1. INTRODUZIONE

1.1) Contesto

Una conoscenza fondamentale dei circuiti elettrici è uno strumento prezioso per comprendere e concettualizzare molti aspetti degli esperimenti e delle teorie fisiologiche. Questo esercizio ha lo scopo di familiarizzarvi con alcuni principi generali relativi a sorgenti di tensione, resistenza elettrica e capacità elettrica. Questi concetti introduttivi forniscono le basi per comprendere fenomeni come la trasmissione sinaptica e la propagazione dei segnali elettrici lungo una fibra nervosa.

Una nota di cautela: nei circuiti elettrici standard della vita quotidiana, composti da fili metallici e resistori, la CORRENTE è trasportata da elettroni, che possiedono una carica negativa. Nei sistemi biologici, la corrente è trasportata da IONI, che possono avere una o più cariche positive o negative. Per convenzione, la corrente fluisce dal polo positivo al polo negativo (anche se, naturalmente, gli elettroni si muovono effettivamente in senso opposto).

I componenti del circuito rappresentano le proprietà elettriche dei tessuti viventi e, in alcuni casi, di oggetti inanimati (come gli elettrodi) coinvolti nel loro studio.

Durante lo svolgimento dell'esercizio, prendi nota dei risultati e dei calcoli.

1.2) Principi generali

Le proprietà fondamentali dei circuiti elettrici attraversati da corrente continua sono descritte dalla legge di Ohm
V = IR
Dove V = tensione in volt (V)
I = corrente in ampere (A)
R = resistenza in ohm (Ω)

Questa legge regola i potenziali che vengono osservati nelle cellule nervose mediante elettrodi. Illustreremo innanzitutto la legge di Ohm e la sua applicazione nei materiali biologici.

1.3) Materiali

Elemento	Quantità
Breadboard	1
Resistori: 330 K Ω	1
: 100 K Ω	12
: 33 K Ω	6
: 22 K Ω	1
: 10 K Ω	6
: 4.7 K Ω	1
: 2.2 K Ω	1
: 1.5 K Ω	1
: 1 K Ω	1
: 510 Ω	1
: 330 Ω	1
: 220 Ω	1
: 150 Ω	1
: 100 Ω	1
Condensatori: 0.1 μF	6
: 10 μF	6
Fili	12
PowerLab	1
Connettori di uscita PowerLab	1
Connettori di ingresso PowerLab	1
Voltmetro (con capacità di misura della corrente)	1

Chiave di decodifica dei resistori

Colore	Cifra
Nero	0
Marrone	1
Rosso	2
Arancione	3
Giallo	4
Verde	5
Blu	6
Viola	7
Grigio	8
Bianco	9
Argento	Tolleranza 10%
Oro	Tolleranza 5%

1^a banda - 1^a cifra
2^a banda - 2^a cifra
3^a banda - Numero di zeri
4^a banda - Tolleranza

Figura 1: Configurazione del sistema. Computer, basetta sperimentale e laboratorio di alimentazione con stimolatore in uscita.

Il sistema PowerLab (interfaccia PowerLab di AD Instruments, Australia) fungerà da sorgente di tensione in questo esperimento. Collegare il cavo USB del PowerLab al computer, accendere il PowerLab e aprire il programma LabChart dal desktop. Selezionare "Nuovo file". Apparirà una finestra con più canali di registrazione. Selezionare "Configurazione" nella parte superiore e fare clic su "Impostazioni canale". Nell'angolo in basso a sinistra della finestra, ridurre il Numero di canali a 1; sul Canale 1, modificare la Portata a 5 V. Collegare il cavo dello stimolatore con i due terminali a gancio mini ai connettori di uscita del PowerLab: collegare il cavo connettore rosso al connettore di uscita positivo e il cavo connettore nero al connettore di uscita negativo. Successivamente, è necessario modificare l'uscita di potenza, la frequenza e la durata dell'impulso del PowerLab. Per fare ciò, selezionare "Configurazione", quindi "Pannello stimolatore". Per la prima parte dell'esperimento sono richiesti impulsi lunghi di 1,5 V, quindi regolare l'ampiezza a 0,75 V; questo fornirà un intervallo di 1,5 V (il PowerLab emetterà una tensione che oscilla tra +0,75 V e -0,75 V). Impostare la frequenza (0,5 Hz) e la durata dell'impulso (1 s).

Figura 2: Schema della basetta sperimentale. Le strisce colorate lungo i lati sono tutte collegate tra loro come un'unica unità per ogni colore. Le 2 colonne orizzontali al centro sono collegate tra loro per ciascuna metà, per una data riga, ma non si collegano attraverso la linea mediana né alle strisce laterali. Ogni riga centrale è indipendente dalla riga successiva.

Quando si utilizza un breadboard, ci sono due colonne su ciascun lato destinate ai collegamenti di ingresso e uscita. Il polo positivo è generalmente collegato alla colonna positiva destra, in cui tutti gli alveoli della colonna sono interconnessi. L'ingresso negativo è collegato al lato opposto del breadboard, dove, anche in questo caso, tutti gli alveoli all'interno di una colonna sono connessi tra loro. Al centro, tra i due gruppi di colonne, si trovano molteplici file di cinque alveoli ciascuna, ognuna indipendente dalle altre. Tutti gli alveoli all'interno di una stessa fila di cinque sono collegati tra loro ma isolati rispetto alle altre file. Si veda la Figura 2. Le aree evidenziate mostrano quali parti del breadboard sono interconnesse. Un video utile sull'utilizzo del breadboard è disponibile online all'indirizzo http://www.youtube.com/watch?v=oiqNaSPTI7w&feature=related

Esercizio 1

Usa la legge di Ohm per calcolare la CORRENTE che scorre nel seguente circuito:

Corrente (Rete 1): ________________ A

Esercizio 2
Misurare la tensione ai capi della resistenza, la resistenza del resistore e la corrente che scorre nel circuito sopra indicato (Rete 1).

Figura 3: Voltmetro Wavetek Meterman.

Ricreare la Rete 1 sulla basetta sperimentale utilizzando una resistenza da 1500 Ω; il PowerLab funge da sorgente di tensione (1,5 V). Le misurazioni di tensione, corrente e resistenza vengono effettuate con il voltmetro. Per ottenere dati accurati, entrambi i puntali rosso e nero del voltmetro devono essere a contatto con il filo nudo nel circuito. Inoltre, la manopola deve essere regolata sulla tensione continua (DC) in un intervallo adeguato alla scala della specifica configurazione sperimentale. Per la misurazione della tensione, toccare entrambi i puntali del voltmetro ai due capi della resistenza. Quando si misura la resistenza della resistenza (e non la caduta di tensione), SCOLLEGARE la sorgente di tensione e, nuovamente, toccare entrambi i puntali ai capi della resistenza. Per misurare la corrente, il voltmetro deve essere inserito in SERIE nel circuito; prestare attenzione al fatto che i puntali rosso e nero devono essere orientati correttamente rispetto al flusso di corrente.

Tensione (Rete 1): ________________V
Resistenza (Rete 1): ________________Ω
Corrente (Rete 1): ________________A

Ora, utilizzando il Power Lab, misurare la tensione attraverso la Rete 2 (identica alla Rete 1, ma su una breadboard), esattamente come fatto con il voltmetro. Scollegare il voltmetro e collegare i cavi della sonda per la misurazione della tensione con le clip rossa e nera. Successivamente, utilizzare il cursore per fare clic su "Channel 1" (lato destro dello schermo). Cliccare e andare su "input amplifier". Quindi, nella finestra, selezionare il pulsante "differential" e impostare l'intervallo a 5 V. Cliccare su "OK" per salvare le modifiche.

Fare clic su "Start" (angolo inferiore destro) per raccogliere i dati. È possibile interrompere in qualsiasi momento per misurare le deflessioni di tensione. Per misurare la tensione raccolta, fare clic su "Stop" e utilizzare il cursore "M" (angolo inferiore sinistro), spostandolo sulla linea di base trascinandolo. Quindi utilizzare il cursore libero fino al punto più alto della traccia di tensione per misurare l'ampiezza. Leggere la variazione di tensione (ΔV) e registrare i dati su carta. È possibile verificare i risultati con il voltmetro autonomo.

1.4) Resistenza e conduttanza in serie

Principio del divisore di tensione: la caduta di tensione attraverso la somma di tutte le resistenze in serie è uguale alla tensione della sorgente. La tensione ai capi di ciascuna resistenza individuale dipende dalla frazione della resistenza totale rappresentata da quella resistenza. Pertanto:

Una coppia di resistenze suddivide una tensione nel rapporto delle rispettive resistenze individuali.

Esercizio 3

Calcola la caduta di tensione su ciascun resistore nella Rete 3. Verifica i tuoi calcoli misurando la tensione effettiva con il voltmetro e il software del power lab, con la sorgente da 1,5 V collegata.

RETE 3. Utilizza i due resistori indicati sopra.

Calcolato:	Misurato:
Tensione (ai capi di R1):_______V	Tensione (ai capi di R1): ________________V
Tensione (ai capi di R2):_______V	Tensione (ai capi di R2): ________________V

1.5) Applicazione biologica del campione:

Le diverse proprietà elettriche dell'interno cellulare e della soluzione esterna di una cellula nervosa attiva forniscono un esempio di partitore di tensione. Questo circuito biologico può essere studiato mediante registrazioni effettuate con elettrodi esterni. La regione attiva della cellula nervosa, dove gli ioni entrano, funge da sorgente di tensione; la corrente fluisce da questa regione lungo l'interno della cellula e ritorna attraverso la soluzione esterna. Pertanto, tra due punti della membrana che differiscono per potenziale, si verifica un flusso di corrente, necessariamente uguale all'interno e all'esterno della fibra; poiché la resistenza all'interno è maggiore rispetto a quella all'esterno, la caduta di tensione maggiore si verifica in questo punto.

Considerare il sistema e il suo circuito equivalente (Figura 4: A. e B.):

Circuito equivalente:

Figura 4: A (in alto). Flusso di corrente elettrica attraverso una membrana cellulare biologica. B (in basso). Circuito elettrico equivalente. La sorgente di tensione (120 mV) è la tensione transmembranaria generata dal potenziale d'azione della cellula nervosa.
Nota: R₀ e R_i sono effettivamente in serie (non in parallelo) a causa della posizione della sorgente di alimentazione. Una rappresentazione equivalente del circuito è la seguente:

Figura 5: Circuito elettrico equivalente alternativo per la Figura 4A.

Esercizio 4.
Sapendo che:
V_m, potenziale attraverso la membrana = 120 mV
R_i, resistenza del fluido interno = 10⁶ Ω
R₀, resistenza del fluido esterno = 10⁴ Ω
Calcolare V₀, il potenziale tra gli elettrodi A e B.
V₀: ________________V

Esercizio 5.

Utilizzando la Rete 4 (vedi sotto), misurare i potenziali ai capi di ciascun resistore (R₀ e R_i).
RETE 4. Collegare i resistori da 4,7 kΩ e 10 kΩ in serie con la sorgente da 1,5 V:

Misurare le tensioni con il voltmetro.
Tensione (ai capi di R₀): ________________V
Tensione (ai capi di R_i): ________________V

RETE 5: Identica alla Rete 4, tranne che R₀ = 1 K Ω
Si noti che nella Rete 5, la resistenza esterna è molto più bassa (analogamente alla presenza di molto liquido o tessuto inattivo che cortocircuita gli elettrodi); per questo motivo è importante registrare dai nervi in aria o sotto olio isolante, per aumentare la resistenza esterna.
Tensione (ai capi di R₀): ________________V
Tensione (ai capi di R_i): ________________V

1.6) Resistenza e conduttanza in serie e in parallelo

Applicazione biologica di esempio:

Un buon esempio di resistenze in serie e in parallelo è la configurazione elettrica di una sinapsi che trasmette in modo chimico. La trasmissione elettrica non è possibile attraverso la maggior parte delle sinapsi a causa dell'effetto di shunt della fessura sinaptica. Si noti, tuttavia, che questo shunt è probabilmente necessario per consentire lo sviluppo di un potenziale elevato attraverso la membrana pre-sinaptica, con conseguente rilascio del neurotrasmettitore.

Figura 6: Modello del flusso elettrochimico attraverso una sinapsi.

Si noti che nei tessuti viventi, significative resistenze elettriche si formano a livello delle membrane e negli spazi extracellulari ristretti. Spazi fluidi relativamente ampi, come il citoplasma cellulare o le soluzioni di bagnatura, non rappresentano resistenze significative.

Esercizio 6.
La rete 6 (vedi sopra e Scheda Circuitale) è un analogo di una sinapsi chimica trasmettente. Nelle sinapsi trasmettenti elettricamente, lo spazio sinaptico (resistenza di shunt R_s) viene eliminato e la corrente fluisce direttamente dalla cellula presinaptica a quella postsinaptica attraverso R_m1 e R_m2, quindi attraverso R_m3. L'attenuazione della rete può essere facilmente misurata con diversi valori di resistenza, illustrando le variazioni in sinapsi differenti. Collegare il PowerLab con 1,5 V (cioè impostazione 0,75 Volt).

1. Misurare la differenza di potenziale (PD) ai capi di ciascun resistore nella rete fornita, utilizzando il multimetro. Annotare i valori dei resistori. Fare particolare attenzione alla PD ai capi di R_m3 (la membrana della cellula postsinaptica). Tensione: ________________V
2. Sostituire il resistore da 330 Ω in R_s con un resistore da 330K Ω. Misurare la PD in R_m3.
3. Ora, mantenendo R_s a 330K Ω, sostituire il resistore da 330K Ω in R_m2 con un resistore da 33K Ω. Misurare la PD ai capi di R_m3. Tensione: ________________V
4. Ora, mantenendo R_s a 330K Ω e R_m2 a 33K Ω, sostituire il resistore da 22K Ω in R_m1 con un resistore da 220 Ω. Misurare la PD ai capi di R_m3. Tensione: ________________V

Esercizio 7
Un esempio di rete resistiva serie-parallelo si verifica quando si considerano le proprietà del cavo della fibra nervosa o muscolare. La COSTANTE DI LUNGHEZZA di una fibra è la distanza alla quale una d.d.p. attraverso la membrana diminuisce fino al 37% del suo valore iniziale. L'attenuazione è dovuta alle resistenze interna ed esterna del liquido su entrambi i lati della membrana, che vengono cortocircuitate dalla resistenza trasversale della membrana (relativamente elevata). Il valore della resistenza limita il trasferimento di un segnale lungo l'assone di una cellula nervosa. La costante di lunghezza è pari a 1/e, misurata in base a un decadimento esponenziale. dE/dT=-E/RC; dove E è la differenza di tensione, R è la resistenza e C è la capacità. Oppure, in un'altra forma, E=E_oexp (-t/RC); dove E_o è la tensione iniziale e t è il tempo in secondi. RC è anche indicato come tau (τ), la costante di tempo.

Assumendo che la resistenza del fluido esterno sia trascurabile rispetto alle resistenze intracellulari e della membrana, le proprietà resistive passive della membrana possono essere rappresentate dal seguente circuito:



Figura 7: Traduzione della rete 7 in un montaggio su basetta sperimentale.

Applica una tensione a un'estremità della Rete 7 tra A e B. Utilizza uno stimolatore, selezionando un impulso della durata di 1 s, ampiezza di 1 V (impostata a 0,5 V) e frequenza di 0,75 Hz. Collega il voltmetro attraverso ciascun resistore di "membrana" a turno e annota la differenza di potenziale (PD) ai capi di quel resistore. Mantieni un'estremità della sonda del voltmetro fissa in (A-lead, Rosso), mentre l'altra sonda viene spostata successivamente lungo le posizioni da 1 a 5. Riporta ogni valore su un grafico della PD in funzione della "distanza" dalla sorgente, con i resistori di membrana posti a distanza unitaria l'uno dall'altro. Dal tuo grafico determina la costante di lunghezza di questo circuito.
Grafico della costante di lunghezza della Rete 7:______________

L'effetto di un aumento della resistenza trasversale della membrana, come si verificherebbe con una guaina mielinica, o di una diminuzione della resistenza longitudinale interna della fibra associata a un aumento del diametro della fibra, consiste in una variazione della costante di lunghezza. I valori delle resistenze non corrispondono a quelli effettivamente presenti in un assone nervoso, ma sono approssimativamente proporzionali. Analogamente, la "distanza unitaria" nel modello è notevolmente ingrandita rispetto a quella di una vera cellula nervosa.

1.7) Capacità

I condensatori immagazzinano carica. Se si applica una tensione a un condensatore attraverso una resistenza, la corrente fluisce nel condensatore e quindi la d.d.p. (differenza di potenziale) ai capi del condensatore aumenta esponenzialmente nel tempo fino a raggiungere il valore della d.d.p. della sorgente; l'andamento temporale di questa variazione di tensione dipende dalla tensione applicata, dalla capacità e dalla resistenza in serie. Un andamento temporale simile, ma invertito, si osserva quando un condensatore si scarica.

Collegare l'ingresso di questa semplice rete resistenza-condensatore (RC) al vostro stimolatore, nei punti A e B. Utilizzare impulsi da 1 V (impostati a 0,5 V) con durata di 1 s e frequenza di 0,75 Hz. È inoltre necessario impostare l'acquisizione a 20 K/sec (lato destro del pannello). Collegare i morsetti di ingresso del PowerLab ai capi del condensatore. Acquisire alcuni secondi di segnale e quindi fermare. Utilizzare la finestra di zoom per ingrandire il tempo di salita di uno degli impulsi quadri. Potrebbe essere necessario ripetere lo zoom più volte per distendere adeguatamente il tracciato. Misurare il tempo di salita dal livello di base fino al picco del tracciato di tensione, proprio nel punto in cui la curva inizia a livellarsi. Osservare l'andamento temporale della variazione di potenziale e la distorsione degli impulsi quadri. Osservare l'effetto della sostituzione del condensatore da 10μF con uno da 0,1 μF. Collegando il puntale voltmetrico del PowerLab ai capi della resistenza, è possibile osservare l'andamento temporale del flusso di corrente nel circuito. Acquisire solo alcuni impulsi e quindi fermare per effettuare le misurazioni. Utilizzare il cursore "M" per posizionarlo sulla linea di base prima dell'inizio della salita e il cursore libero nel punto in cui la tensione inizia a livellarsi.

L'ultimo esempio comprende sia componenti resistivi che capacitivi. Le proprietà passive di tipo cavo nelle fibre nervose e muscolari sono determinate da elementi simili, derivanti dalle proprietà della membrana cellulare. Oltre alla resistenza trasversale della membrana presente nella cellula, esiste anche una capacità membranaria, dovuta alle proprietà elettriche della membrana cellulare. L'effetto di ciò consiste nel modificare l'andamento temporale dello sviluppo dei potenziali diffusi elettrotonicamente.

Esempio:

Questa rete può essere costruita a partire dalla Rete 7 collegando in parallelo ai resistori di membrana (Rm) i condensatori richiesti.

Esercizio 8.
Collegare al circuito 7 i condensatori da 10 μF. Utilizzando impulsi da 1 s, 1 V (impostazione 0,5 V) e 0,75 Hz provenienti dallo stimolatore, che deve essere collegato ai punti A e B, osservare le variazioni di potenziale attraverso ciascun resistore di membrana. Assumendo che la tensione "soglia" (la tensione alla quale viene generato un potenziale d'azione in una cellula nervosa) sia di 0,2 V, misurare il tempo necessario affinché il potenziale raggiunga la soglia in ciascun resistore di membrana. Per soglia si intende qui il valore di potenziale al quale può essere generato un potenziale d'azione in una cellula vivente. Riportare i risultati in un grafico con il tempo in funzione della "distanza".

Figura 8: Traduzione della rete 9 su un circuito montato su breadboard.

Grafico per la Figura 8.

Simulare l'effetto di una diminuzione della capacità della membrana prodotta da un aumento dello spessore della guaina mielinica sostituendo i condensatori più piccoli da 0,1 μF. Osservare il cambiamento del tempo necessario per raggiungere la soglia in un resistore selezionato. Sovrapporre i dati sullo stesso grafico con i condensatori più grandi posizionati.

Per quanto riguarda la membrana muscolare, si può pensare a un aumento della capacità dovuto all'aumento della superficie della membrana causato dai tubuli T associati, il che comporta una capacità membranaria maggiore rispetto a quella di un neurone. Condensatori più piccoli possono essere utilizzati per illustrare la riduzione della capacità causata dall'aggiunta di guaina mielinica a un assone nervoso non mielinizzato. Il punto principale da apprendere è che la capacità elettrica è proporzionale alla superficie e inversamente proporzionale allo spessore dello strato dielettrico (mielina) che separa le "armature" o superfici di accumulo del condensatore.

Le proprietà presentate in un circuito modello vengono osservate in preparati vivi. Tuttavia, le cellule variano nelle loro proprietà, come la perdita di carica attraverso la membrana e la resistenza assiale. Alcune cellule non generano potenziali d'azione. Tuttavia, un potenziale d'azione viene prodotto quando è necessario trasmettere un segnale per alcuni millimetri, poiché le proprietà elettriche passive delle cellule attenuano i segnali su distanze di alcuni millimetri. Nella prossima serie di esperimenti viene illustrata la registrazione dei potenziali d'azione.

1.8) Domande per gli studenti

1. Quali sono alcuni valori normali della costante di lunghezza per neuroni e cellule muscolari?
2. Cosa succederebbe se una membrana avesse una bassa resistenza di membrana: cambierebbe la costante di tempo (tempo necessario per raggiungere il 63% del valore finale)? In caso affermativo, come cambierebbe con una resistenza di membrana più bassa? Qual è la formula matematica generalizzata per la costante di tempo (tau)?
3. Perché gli assoni più grandi, come l'assone gigante del calamaro, possono condurre segnali elettrici più velocemente rispetto agli assoni più piccoli nella stessa preparazione di calamaro?

2. PROPRIETÀ DI CONDUZIONE DELLE CELLULE NERVOSA

2.1) Da una scheda elettronica a cellule viventi

Le proprietà passive dimostrate negli esercizi con la scheda circuitale sono misurabili anche nelle cellule viventi; tuttavia, queste proprietà passive possono risultare complesse da isolare quando sono accompagnate da potenziali d'azione nelle cellule nervose. Le proprietà attive del neurone consistono nella capacità di mantenere un potenziale di membrana a riposo, generare potenziali d'azione e rigenerarli lungo un tratto di membrana.

Il flusso elettrico lungo un cordone nervoso può essere rigenerativo sia all'interno di singoli neuroni sia da un neurone al successivo. Nel cordone nervoso ventrale dell'astice (VNC), alcuni neuroni comunicano attraverso giunzioni settate (ovvero giunzioni di tipo gap). Come dimostrato nei precedenti esercizi con la breadboard, la modifica della resistenza può ostacolare la conduzione dei segnali elettrici. Questo fenomeno è analogo alla modifica del flusso di corrente attraverso le giunzioni di tipo gap presenti nel cordone nervoso ventrale.

La velocità di conduzione e altre proprietà del potenziale d'azione composto nel VNC vengono esaminate nella prossima serie di esperimenti. Illustreremo come ottenere il VNC per gli esperimenti e come evocare e misurare le risposte utilizzando apparecchiature standard progettate per i laboratori didattici per studenti.

2.2) Preparazione del gambero di fiume

Il cordone nervoso ventrale dell'astice è il più adatto per questo esperimento. Il nervo può essere facilmente dissezionato e con questo preparato è possibile utilizzare una varietà di protocolli che influenzano la conduzione. Prima di iniziare l'esperimento, familiarizzare con i termini di anatomia dell'astice riportati di seguito:

Figura 9. Diagramma generale dell'anatomia dell'astice.
Modificato da: http://www.enchantedlearning.com

2.3) Fondamenti sulla conduzione in un nervo

Il cordone nervoso ventrale dell'astice svolge la funzione di trasmettere segnali che innescano risposte di fuga, come la reazione di scatto della coda. In questo esperimento, verranno effettuate registrazioni dall'intero cordone nervoso intatto. I potenziali individuali di ciascun neurone all'interno del cordone nervoso si sommano per generare il potenziale d'azione composto, che produce gli impulsi elettrici misurabili mostrati dal software di registrazione. Erlanger, Gasser e Bishop (1924) sono alcuni dei pionieri che hanno descritto i potenziali d'azione composti. Vengono illustrati le caratteristiche del periodo refrattario, della velocità di conduzione e degli effetti neurali dell'inibitore delle giunzioni comunicanti 1-eptanolo o della temperatura. L'apprendimento dei principi fondamentali dei segnali delle cellule nervose contribuisce a una migliore comprensione della funzione neurologica in generale (Bennett, et al., 1991; Furshpan et al., 1959; Watanabe e Grundfest, 1961).

2.4) Materiali

Elemento	Quantità
Gambero di fiume grande (Procambarus clarkii)	1
Forbici da dissezione di precisione	1
Pinzette	1
Camera per nervi MLT016/X	1
Computer portatile con software Scope	1
PowerLab	1
Amplificatore PowerLab	1
Cavo di uscita stimolatore per PowerLab	1
Connettore USB PowerLab/Computer	1
Supporto con manipolatore ed elettrodo a sifone	1
Pipetta di vetro con bulbo	1
Beccherino di soluzione salina per gambero di fiume	1

2.5) Metodi

2.5.1) Dissezione

Assicurarsi che la capsula nervosa, i vari strumenti e le soluzioni siano pronti prima di dissezionare un gambero.

1. Avvolgere l'astice in un tovagliolo di carta umido per tenerlo fermo oppure tenerlo con una mano, posizionando le chele (chelepedi) tra pollice e indice.
2. Con l'altra mano, praticare un'incisione con le forbici attraverso il rostro, tra le orbite oculari.
   
3. Tagliare verso il basso a partire dall'incisione fino a quando la testa è completamente staccata.
4. Praticare un'incisione alla base del cefalotorace, sopra l'addome; rimuovere la coda. (Se necessario, è possibile rimuovere le chele e le zampe ambulacrali per facilitare questa operazione.)
   
5. Rimuovere i nuotatori.
   
6. Praticare un'incisione lungo entrambi i lati della superficie ventrale dell'addome. Prestare attenzione a non danneggiare i tessuti sottostanti.
   
7. Sollevare all'indietro la sezione libera dell'esoscheletro fino alla base del ventaglio caudale per esporre il cordone nervoso ventrale.
   
8. Utilizzando il bordo della pinzetta, rimuovere con cura il cordone nervoso ventrale dalla punta. Prestare attenzione a non stirare né schiacciare il cordone nervoso. (Eventuali noduli osservati sul cordone nervoso corrispondono ai gangli dell'astice.)
   
9. Disporre il cordone nervoso attraverso le barre metalliche nella camera nervosa. È fondamentale mantenere il cordone nervoso ventrale umido. A tale scopo, aggiungere nella camera nervosa una quantità sufficiente di soluzione salina per astici fino a raggiungere un livello pari a quello delle traverse metalliche. Successivamente, prelevare con la pipetta una parte della soluzione salina per astici in modo che il livello del liquido tocchi appena la parte inferiore delle barre.
   Soluzione Salina per Astici (mM: 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl₂.2H₂O; 2.45 MgCl₂.6H₂O; 5 HEPES aggiustato a pH 7.4)
10. Una volta posizionato il nervo, collegare il cavo dello stimolatore con i due elettrodi a gancio miniaturizzati alla camera nervosa. Collegare il cavo positivo rosso a uno dei loop metallici esterni vicino all'estremità del cordone nervoso; collegare il cavo negativo nero al loop metallico adiacente più vicino ancora a contatto con il cordone nervoso.
    
11. Posizionare l'elettrodo a suzione all'interno del manipolatore vicino all'estremità opposta del nervo.
12. Aspirare con attenzione la punta del cordone nervoso ventrale all'interno dell'elettrodo di registrazione.

2.5.2) Registrazione

Una volta che la punta del cordone nervoso è stata aspirata all'interno dell'elettrodo di registrazione, assicurarsi che l'elettrodo sia collegato alla sonda e che la sonda sia adeguatamente messa a terra. Questo può essere ottenuto semplicemente collegando il cavo di massa alla gabbia di Faraday. I fili positivo e negativo dell'elettrodo a vuoto devono inoltre essere collegati alle rispettive posizioni sulla sonda. La sonda deve essere collegata all'amplificatore differenziale, che a sua volta è connesso al PowerLab.

Collegare i fili elettrici dell'elettrodo di aspirazione allo stadio di testa. I fili devono essere collegati con il rosso (positivo) in alto a sinistra, il verde (terra) al centro e il nero (negativo) in basso. Questo è indicato nella Figura 10 per lo stadio di testa riportato di seguito. Il filo di terra può essere semplicemente posizionato nel bagno di soluzione salina. Pertanto, un filo dell'elettrodo di aspirazione va all'ingresso + e l'altro all'ingresso -. Non importa quale dei due fili dell'elettrodo di aspirazione venga collegato all'ingresso + o all'ingresso -.

Figura 10: Ingressi per lo stadio di testa

Le impostazioni per l'amplificatore sono le seguenti:

CONTROLLO	IMPOSTAZIONE
Passa alto	DC
Filtro notch	OFF
Passa basso	20kHz
Compensazione capacità	In senso antiorario
Manopola offset DC fine e grossolana	In senso antiorario
Offset DC (+OFF)	OFF
Manopola guadagno	50
Ingresso (DIFF MONO GND)	DIFF
MODALITÀ (STIM-GATE-REC)	GATE
ΩTEST	OFF

Collegare il cavo USB fornito sul retro del PowerLab e alla presa del computer. Aprire il software Scope sul desktop del computer. In alto a destra sullo schermo, selezionare "Canale 2" e spegnerlo. Regolare lo schermo in modo che sia visualizzato solo il Canale 1, spostando la barra al centro dello schermo verso il basso. Successivamente, fare clic su "Amplificatore di ingresso" per il canale 1 in alto a destra sullo schermo. Selezionare quanto segue:

CONTROLLO	IMPOSTAZIONE
INTERVALLO	500 mV
AC	SELEZIONATO
PASSA BASSO	SPENTO
SINGOLO ESTREMO	SELEZIONATO
INVERTI	SELEZIONATO

Successivamente, nuovamente sotto "Imposta", fare clic su "Campionamento". Nella finestra intitolata "Scansione" che appare sullo schermo, selezionare quanto segue:

CONTROLLO	IMPOSTAZIONE
MODALITÀ	MULTIPLA
CAMPIONE	100 SCANSIONI
SORGENTE	UTENTE
RITARDO	0 SECONDI

Infine, nella scheda "Set up", selezionare "Stimulator". Fare clic sulla casella per disattivare "Isolated Stim". Scegliere le seguenti impostazioni:

CONTROLLO	IMPOSTAZIONE
MODALITÀ	MULTIPLA
RITARDO	5 ms
DURATA	1 ms
IMPULSO(I)	2
INTERVALLO	15 ms
CAMPO	5 V
AMPIEZZA	0,5

Vedere "Base dei tempi" nel pannello destro. Impostare "Campionamento" su 1024 e "Tempo" su 200 msec.

Figura 11: Due potenziali d'azione composti con intervallo di 15 msec tra gli stimoli, registrati con il software Scope.

Esercizio 1.

Selezionare il pulsante "Start" nell'angolo inferiore sinistro dello schermo. Con le impostazioni sopra indicate, dovrebbe apparire una potenziale d'azione composto ben definito nella finestra di acquisizione dati dello Scope (Figura 11). Disegnare la forma generale del potenziale d'azione nel grafico sottostante (Figura 12):

Figura 12: Grafico vuoto per disegnare la forma del potenziale d'azione composto.

Ridurre lentamente la tensione utilizzando la scheda in alto a sinistra dello schermo. Il potenziale d'azione dovrebbe diminuire in ampiezza fino a quando il suo caratteristico andamento ondulatorio scompare. La riduzione della tensione diminuisce il numero di neuroni reclutati per generare il potenziale d'azione composto. Gli assoni di maggiori dimensioni sono probabilmente quelli reclutati a tensioni più basse e sono anche i più veloci nella conduzione, tendendo quindi a comparire per primi nel potenziale d'azione composto. Aumentare progressivamente la tensione per osservare l'effetto opposto; man mano che vengono reclutati più neuroni, l'onda del potenziale d'azione composto aumenta di ampiezza. Questo esercizio illustra il fatto che i singoli neuroni presentano diverse soglie di attivazione per la generazione del potenziale d'azione. Quando il potenziale d'azione composto non aumenta ulteriormente all'aumentare della tensione di stimolazione, tutti i neuroni sono stati reclutati; sullo schermo del computer dovrebbero essere visibili due picchi distinti nell'onda del potenziale d'azione.

Esercizio 2.

Dopo aver esaminato il reclutamento dei neuroni e il potenziale d'azione composto risultante, osservare l'effetto del periodo refrattario. Questo può essere fatto somministrando due stimoli ravvicinati nel tempo e variando l'intervallo interstimolo, quindi osservando a quale intervallo interstimolo il potenziale d'azione composto, evocato dal secondo stimolo, presenta un'ampiezza ridotta rispetto al primo potenziale d'azione composto. Modificare il ritardo tra gli impulsi utilizzando la scheda nell'angolo in alto a sinistra dello schermo. Continuare ad accorciare il ritardo finché non si riesce a evocare il secondo potenziale d'azione composto. L'intervallo di tempo tra gli impulsi al quale non viene più evocato un secondo potenziale d'azione è il periodo refrattario assoluto. L'intervallo di tempo tra la fine del periodo refrattario assoluto e il momento in cui un secondo stimolo genera un potenziale d'azione di ampiezza massima è definito periodo refrattario relativo. Fornire una stima dei periodi refrattari assoluto e relativo negli spazi previsti.
Periodo Refrattario Assoluto: ___________________
Periodo Refrattario Relativo: ___________________

2.5.3) Misurazione della velocità di conduzione

Con un righello millimetrato, misurare la distanza tra il filo stimolante più vicino all'elettrodo di registrazione e l'elettrodo di registrazione. Dalla traccia registrata, misurare il tempo necessario per raggiungere i vari picchi degli eventi nel potenziale composto, in modo da poter registrare la velocità di conduzione dei diversi segnali elettrici. Convertire la distanza da millimetri a metri e il tempo da millisecondi a secondi per ottenere come unità metri/secondo.
1^a velocità di conduzione dell'onda: __________________
2^a velocità di conduzione dell'onda: __________________
3^a velocità di conduzione dell'onda: __________________
4^a velocità di conduzione dell'onda: __________________

2.5.4) Manipolazione dei giunzioni comunicanti e/o della velocità di conduzione

Successivamente, analizzare le proprietà di un inibitore neuronale. L'effetto di disaccoppiamento dell'eptanolo è stato descritto per la prima volta negli assoni settati di gambero (cioè, giunzioni comunicanti) da Johnston et al. (1980). Tale effetto, relativo alla comunicazione elettrica, è stato rapidamente confermato in diversi sistemi di vertebrati e invertebrati (Bernardini et al., 1984; Meda et al., 1986). Per comprendere il ruolo della comunicazione elettrica in questo cordone nervoso ventrale, si può utilizzare una soluzione salina contenente 1-eptanolo (1 mM) per disaccoppiare le giunzioni comunicanti. Con una pipetta di vetro, lavare l'intero cordone nervoso con una soluzione di eptanolo. Osservare la variazione registrata dal software di acquisizione Scope e riassumerla. (Notare il cambiamento nella forma d'onda e se la velocità di conduzione delle forme d'onda è modificata). In alternativa, invece di utilizzare 1-eptanolo, si può sostituire la soluzione salina di bagnatura con soluzione salina fredda ghiacciata e monitorare eventuali cambiamenti nella forma d'onda o nella velocità di conduzione delle forme d'onda.

Discussione

Il nostro obiettivo nella presentazione on-line video e questo lavoro è quello di dimostrare che le proprietà biofisiche delle cellule può, in parte, essere modellati come circuiti elettrici. Inoltre, con vivo tessuto neurale che è relativamente facile ottenere, principi fondamentali della velocità di conduzione, periodi refrattari e le tecniche di registrazione elettrofisiologica sono possibili per i laboratori di studente universitario con un investimento modesto di attrezzature. I temi e paradigmi fondamentali presentate possono essere facilmente modificato per le esigenze di diversi corsi.

Manutenzione dei gamberi e la loro abbondanza li rende attraenti modelli per gli studenti-driven sperimentazione. Cordoni nervosi crostaceo ventrali sono generalmente robusti e conservare l'integrità fisiologica salina in un minimo di ore, che è adeguata per un laboratorio studente 3 ore.

Dato che alcuni dei grandi assoni nel VNC del gambero sono collegati mediante giunzioni gap, la sperimentazione supplementare sul loro contributo può essere condotta, e le proprietà diversa da quella nella norma preparazione rana nervo sciatico può essere dimostrata. Il nervo sciatico è un modello classico per affrontare i potenziali d'azione complesso e le proprietà di conduzione. Potrebbe anche essere un esperimento interessante comparativa per gli studenti di confrontare le proprietà di conduzione, di reclutamento assone, e periodi refrattari tra queste due preparazioni.

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